本發(fā)明涉及利用crispr/cas12a(cpf1)核酸酶系統(tǒng)在精確位置處切割(cleave)活生物體的雙鏈dna的能力。具體地，描述了在真核細胞環(huán)境中有用的一系列重組cas12a蛋白。

背景技術：

1、cas12a是發(fā)現(xiàn)于包括氨基酸球菌屬(acidaminococcus?sp.)的細菌物種中的rna導向的核酸內切酶并且是成簇規(guī)律間隔的短回文重復(crispr)適應性免疫系統(tǒng)的一部分。通過靶位點特異性21～24-nt互補rna，cas12a導向至21～24-nt?dna靶序列，或通常稱為前間隔序列。cas12a-grna核糖核蛋白(rnp)復合體介導雙鏈dna斷裂(dsb)，然后通過非同源末端連接(nhej，通常在剪切位點引入突變或插入缺失突變(indels))或者通過同源定向修復(hdr)系統(tǒng)(用于精確編輯，若存在合適的模板核酸的話)進行修復。

2、識別cas12a的正確dna靶標的關鍵包括crrna和規(guī)范的“tttv”前間隔序列鄰近基序(pam)兩者，其是緊鄰前間隔序列上游的4-bp序列。與來自化膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)的cas9的2-bpngg?pam相比，cas12a擴展了基因組編輯中的可靶向基因座，特別是在cas9系統(tǒng)難以接觸的富at位點上。但是，由于其酶活性相對較低，對于給定位點可以實現(xiàn)有效的基因組編輯的可能性遠低于cas9系統(tǒng)，這限制了其更廣泛的應用。因此，僅當cas9無法靶向基因組位點時，才經常將cas12a系統(tǒng)視為替代方法。

3、通過誘變進行的蛋白質工程改造可以改變crispr系統(tǒng)pam序列的偏好。通過結構導向的pam序列附近殘基的誘變篩選，先前的研究已經鑒定出兩個分別與tycv和tatv?pam相容的ascpf1變體。盡管這些變體共同將cpf1系統(tǒng)的可靶向位點在人類基因組編碼區(qū)擴增了3倍，但由于其對pam序列的互斥要求(tycv對(vs)tatv對tttv)，每個變體的效用仍然有限。在不犧牲規(guī)范pam位點處的活性的情況下，鑒定具有較短pam和較大序列柔性的cpf1變體是非?？扇〉摹?/p>

4、因此，需要增強cas12a的效用。本技術的一個方面是通過拓寬其pam相容性來提高cpf1的效用。就此而言，已經發(fā)現(xiàn)了某些具有提高活性的新型ascas12a變體。另一個期望的目標是使細菌蛋白最大程度地傳遞至真核細胞的核，同時避免破壞基礎cas12a功能。由于cas12a是細菌蛋白，因此必須首先克服某些分子遺傳障礙，然后才能將蛋白質成功傳遞到真核細胞。本發(fā)明提供了實現(xiàn)這些目標的獨特解決方案。

技術實現(xiàn)思路

1、在第一方面中，提供了crispr相關蛋白，其包含編碼ascpf1變體的多肽。所述ascpf1變體選自由以下項組成的組：m537r(seq?id?no.:472)、f870l(seq?id?no.:473)和m537r/f870l(seq?id?no.:465)。

2、在第二方面中，提供了crispr核糖核蛋白復合體。所述crispr核糖核蛋白復合體包含向導rna和crispr相關蛋白。所述crispr相關蛋白包含編碼ascpf1變體的多肽。所述ascpf1變體選自由以下項組成的組：m537r(seq?id?no.:472)、f870l(seq?id?no.:473)和m537r/f870l(seq?id?no.:465)。

3、在第三方面中，提供了用crispr核糖核蛋白復合體提高細胞中tttn?pam位點處的基因編輯效率的方法。所述方法包括使細胞與crispr核糖核蛋白復合體接觸。所述crispr核糖核蛋白復合體包含向導rna和crispr相關蛋白。所述crispr相關蛋白包含編碼ascpf1變體的多肽。所述ascpf1變體選自由以下項組成的組：m537r(seq?id?no.:472)、f870l(seqid?no.:473)和m537r/f870l(seq?id?no.:465)。

4、在第四方面中，提供了試劑盒，其包含向導rna和crispr相關蛋白。所述crispr相關蛋白包含編碼ascpf1變體的多肽。

5、在第五方面中，提供了crispr相關蛋白，其包含編碼ascas12a變體的多肽，其中所述ascas12a變體選自由至少一個選自氨基酸位置499-640和840-913的變異氨基酸組成的組，前提條件是所述變異ascas12a在非規(guī)范tttt?pam位點處提供crispr/ascas12a相關核酸酶活性的改善。

6、在第六方面中，提供了crispr核糖核蛋白復合體。所述crispr核糖核蛋白復合體包含向導rna和crispr相關蛋白。所述crispr相關蛋白包含編碼ascas12a變體的多肽，其中所述ascas12a變體選自由至少一個選自氨基酸位置499-640和840-913的變異氨基酸組成的組，前提條件是所述變異ascas12a在非規(guī)范tttt?pam位點處提供crispr/ascas12a相關核酸酶活性的改善。

7、在第七方面中，提供了用crispr核糖核蛋白復合體提高細胞中在非規(guī)范tttn?pam位點處的基因編輯效率的方法。所述方法包括使細胞與包含向導rna和crispr相關蛋白的crispr核糖核蛋白復合體接觸。所述crispr相關蛋白包含編碼ascas12a變體的多肽，其中所述ascas12a變體選自由至少一個選自氨基酸位置499-640和840-913的變異氨基酸組成的組，前提條件是所述變異ascas12a在非規(guī)范tttt?pam位點處提供crispr/ascas12a相關核酸酶活性的改善。

8、在第八方面中，提供了試劑盒，其包含向導rna和crispr相關蛋白，所述crispr相關蛋白包含編碼ascas12a變體的多肽。所述ascas12a變體選自由至少一個選自氨基酸位置499-640和840-913的變異氨基酸組成的組，前提條件是所述變異ascas12a在非規(guī)范ttttpam位點處提供crispr/ascas12a相關核酸酶活性的改善。

9、在第九方面中，提供了編碼crispr相關蛋白的核酸，所述crispr相關蛋白包含編碼ascas12a變體的多肽。所述ascas12a變體選自由至少一個選自氨基酸位置499-640和840-913的變異氨基酸組成的組，前提條件是所述變異ascas12a在非規(guī)范tttt?pam位點處提供crispr/ascas12a相關核酸酶活性的改善。

10、在第十方面中，提供了編碼cas12a多肽的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列包含選自由seq?id?no.:5-17組成的組的一個成員。

11、在第十一方面中，提供了編碼cas12a多肽的氨基酸序列。所述氨基酸序列包含選自由seq?id?no.:18-30組成的組的一個成員。

12、在第十二方面中，提供了cas核酸內切酶系統(tǒng)，其包含編碼多核苷酸序列的表達盒，所述多核苷酸序列編碼cas12a多肽。包含選自由seq?id?no.:5-17組成的組的一個成員。

13、在第十三方面中，提供了cas核酸內切酶系統(tǒng)，其包含編碼cas12a多肽的氨基酸序列。所述氨基酸序列包含選自由seq?id?no.:18-30組成的組的一個成員。

14、在第十四方面中，提供了在真核細胞中進行基因組編輯的方法。所述方法包括以下步驟：將cas核酸內切酶系統(tǒng)引入到真核細胞中，所述cas核酸內切酶系統(tǒng)包含編碼多核苷酸序列的表達盒，所述多核苷酸序列編碼cas12a多肽，所述多核苷酸序列包含選自由seqid?no.:5-17組成的組的一個成員。

15、在第十五方面中，提供了在真核細胞中進行基因組編輯的方法。所述方法包括以下步驟：將cas核酸內切酶系統(tǒng)引入到真核細胞中，所述cas核酸內切酶系統(tǒng)包含編碼cas12a多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含選自由seq?id?no.:18-30組成的組的一個成員。

16、在第十六方面中，提供了crispr相關蛋白，其包含融合多肽。所述融合多肽包含ascas12a開放閱讀框、核定位信號、任選的氨基酸接頭和任選的親和標簽。

17、在第十七方面中，提供了在真核細胞中進行基因組編輯的方法。所述方法包括以下步驟：將cas核酸內切酶系統(tǒng)引入到真核細胞中，所述cas核酸內切酶系統(tǒng)包含根據(jù)第十六方面的crispr相關蛋白。