本發(fā)明屬于生物，具體涉及zmphr1蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、干旱是影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要非生物脅迫，是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的主要難題之一。水分脅迫會(huì)抑制作物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，導(dǎo)致株高變矮，葉片萎蔫，光合作用減少，有機(jī)物積累和結(jié)實(shí)率下降，籽?；蚬麑?shí)不飽滿(mǎn)，使作物產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。玉米是世界三大糧食作物之一，種植區(qū)域廣泛，起源于濕熱的熱帶地區(qū)，不耐干旱。玉米在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要大量水分供應(yīng)，干旱脅迫影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，是造成玉米減產(chǎn)的最主要環(huán)境因素。此外，干旱脅迫還嚴(yán)重降低玉米籽粒的品質(zhì)。

2、玉米是我國(guó)第一大糧食品種，占糧食種植面積的42％，在中國(guó)各地都有種植，其中東北、華北和西南地區(qū)較多。培育抗旱新品種能夠有效應(yīng)對(duì)干旱脅迫造成的產(chǎn)量損失，提高水分利用效率。如何利用新技術(shù)和新方法，通過(guò)對(duì)重要基因進(jìn)行遺傳改造，提高玉米抗旱性，最終獲得抗逆新品種，是現(xiàn)代基礎(chǔ)生物學(xué)和農(nóng)業(yè)育種的共同目標(biāo)之一。通過(guò)基因工程手段將重要基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和突變，是現(xiàn)代分子育種的一個(gè)重要組成部分。在作物中常用方法是將某個(gè)或幾個(gè)參與重要生理過(guò)程的基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，或通過(guò)crispr/cas9等基因編輯技術(shù)將基因進(jìn)行突變，獲得抗逆新品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的問(wèn)題是如何調(diào)控植物抗旱性、培育抗旱植物品種。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了zmphr1蛋白或與zmphr1蛋白相關(guān)的生物材料的新用途。

3、本發(fā)明提供了zmphr1蛋白或與zmphr1蛋白相關(guān)的生物材料在如下s1)-s6)任一種中的應(yīng)用：

4、s1)調(diào)控植物抗旱性；

5、s2)調(diào)控植物葉片蒸騰速率和/或氣孔導(dǎo)度；

6、s3)調(diào)控植物葉片氣孔開(kāi)度；

7、s4)調(diào)控植物葉片氣孔運(yùn)動(dòng)；

8、s5)培育抗旱性提高和/或蒸騰速率降低和/或氣孔導(dǎo)度降低和/或氣孔開(kāi)度降低的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；

9、s6)植物遺傳育種或植物種質(zhì)資源改良；

10、所述zmphr1蛋白為a1)或a2)或a3)或a4)：

11、a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白質(zhì)；

12、a2)在序列3所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

13、a3)將序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物抗旱性相關(guān)的蛋白質(zhì)；

14、a4)將序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、來(lái)源于玉米且與植物抗旱性相關(guān)的蛋白質(zhì)；

15、所述生物材料為下述a1)至a8)中的任一種：

16、a1)編碼zmphr1蛋白的核酸分子；

17、a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

18、a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；

19、a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；

20、a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；

21、a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

22、a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；

23、a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物。

24、上述a2)所述的蛋白質(zhì)中，所述標(biāo)簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化。所述標(biāo)簽可為flag標(biāo)簽、his標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、gst標(biāo)簽和/或sumo標(biāo)簽等。

25、上述a3)所述的蛋白質(zhì)中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)9個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)8個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)7個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)6個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)5個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)4個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)3個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)2個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過(guò)1個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

26、上述a4)所述的蛋白質(zhì)中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁(yè)網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁(yè)。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過(guò)使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambdaratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索1對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值(％)。所述同一性包括與本發(fā)明的序列4所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。

27、上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

28、上述a1)中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

29、所述核酸分子具體可為如下b1)或b2)或b3)所示的基因：

30、b1)序列1所示的dna分子；

31、b2)序列2所示的dna分子；

32、b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼zmphr1蛋白的dna分子。

33、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼zmphr1蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有編碼zmphr1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼zmphr1蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

34、這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

35、上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

36、上述a2)中，所述表達(dá)盒(zmphr1基因表達(dá)盒)是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)zmphr1蛋白的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)zmphr1轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止zmphr1轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv?35s終止子、tml終止子、豌豆rbcs?e9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子。

37、上述a3)和a4)中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述重組載體可為利用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建得到的含有上述核酸分子或上述表達(dá)盒的載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒基因(如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

38、上述a5)-a8)中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。所述重組微生物可為含有上述核酸分子或上述表達(dá)盒或上述重組載體的微生物。

39、上述s1)中所述的調(diào)控植物抗旱性為提高植物抗旱性，具體體現(xiàn)為植物中zmphr1蛋白含量和/或活性越高或zmphr1基因表達(dá)量越高，該植物在干旱條件下的生長(zhǎng)發(fā)育越好、葉片萎蔫程度越低、葉片含水量越高、存活率越高。

40、所述s2)中所述的調(diào)控植物葉片蒸騰速率為降低植物葉片蒸騰速率；所述調(diào)控植物葉片氣孔導(dǎo)度為降低植物葉片氣孔導(dǎo)度。

41、所述s3)中所述的調(diào)控植物葉片氣孔開(kāi)度為降低植物葉片氣孔開(kāi)度。

42、所述s4)中所述的調(diào)控植物葉片氣孔運(yùn)動(dòng)為抑制植物葉片氣孔打開(kāi)或促進(jìn)植物葉片氣孔關(guān)閉。

43、所述s6)中所述的植物遺傳育種或植物種質(zhì)資源改良的目的為培育抗旱植物品種。

44、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明又提供了抑制zmphr1蛋白的物質(zhì)的新用途；

45、本發(fā)明提供了抑制zmphr1蛋白的物質(zhì)在如下t1)-t6)任一種中的應(yīng)用：

46、t1)降低植物抗旱性；

47、t2)提高植物葉片蒸騰速率和/或氣孔導(dǎo)度；

48、t3)提高植物葉片氣孔開(kāi)度；

49、t4)促進(jìn)植物葉片氣孔運(yùn)動(dòng)；

50、t5)培育抗旱性降低和/或蒸騰速率提高和/或氣孔導(dǎo)度提高和/或氣孔開(kāi)度提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；

51、t6)植物遺傳育種或植物種質(zhì)資源改良。

52、上述t6)中所述的植物遺傳育種或植物種質(zhì)資源改良的目的為培育抗旱性降低和/或蒸騰速率提高和/或氣孔導(dǎo)度提高和/或氣孔開(kāi)度提高的轉(zhuǎn)基因植物。

53、進(jìn)一步的，所述抑制zmphr1蛋白的物質(zhì)可為抑制zmphr1蛋白活性的物質(zhì)或抑制編碼zmphr1蛋白基因表達(dá)的物質(zhì)或敲除編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)。

54、所述抑制zmphr1蛋白活性的物質(zhì)可為任何能夠使植物中zmphr1蛋白活性缺失的物質(zhì)，如抑制zmphr1蛋白合成或促進(jìn)zmphr1蛋白降解或抑制zmphr1蛋白功能的蛋白質(zhì)、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制劑)。

55、所述抑制編碼zmphr1蛋白基因表達(dá)的物質(zhì)可為任何能夠使植物中編碼zmphr1蛋白的基因無(wú)法表達(dá)的物質(zhì)，如沉默植物中編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)(如mirna、sirna、dsrna、shrna等)。

56、所述敲除編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)可以是以任何方式實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞不產(chǎn)生zmphr1基因的功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的物質(zhì)，具體方式如去除全部或部分編碼基因序列、引入移碼突變使得不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)、去除或改變調(diào)節(jié)組分(例如啟動(dòng)子編輯)使得編碼基因序列不被轉(zhuǎn)錄、通過(guò)與mrna的結(jié)合阻止翻譯等。通常，敲除在基因組dna水平上進(jìn)行，使得細(xì)胞的后代也永久地?cái)y帶敲除。進(jìn)一步的，所述敲除編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)可為任何能夠使植物中編碼zmphr1蛋白基因發(fā)生突變(所述突變形式可為缺失突變和/或插入突變和/或堿基替換)從而失去活性的物質(zhì)，如鋅指蛋白zfn基因編輯系統(tǒng)或talens基因編輯系統(tǒng)或crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)等。

57、更進(jìn)一步的，所述敲除編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)為敲除編碼zmphr1蛋白基因的載體。

58、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育抗旱性提高和/或蒸騰速率降低和/或氣孔導(dǎo)度降低和/或氣孔開(kāi)度降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

59、本發(fā)明提供的培育抗旱性提高和/或蒸騰速率降低和/或氣孔導(dǎo)度降低和/或氣孔開(kāi)度降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括如下步驟：提高受體植物中zmphr1蛋白的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性高于所述受體植物，蒸騰速率和/或氣孔導(dǎo)度和/或氣孔開(kāi)度低于所述受體植物。

60、進(jìn)一步的，所述提高受體植物中zmphr1蛋白的含量和/或活性的方法為在受體植物中過(guò)表達(dá)zmphr1蛋白。

61、所述轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性高于所述受體植物具體體現(xiàn)在如下x1)-x4)中的任一種：

62、x1)在干旱條件下，所述轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)情況優(yōu)于所述受體植物；

63、x2)在干旱條件下，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片萎蔫程度低于所述受體植物；

64、x3)在干旱條件下，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉片含水量高于所述受體植物；

65、x4)在干旱條件下，所述轉(zhuǎn)基因植物的存活率高于所述受體植物。

66、更進(jìn)一步的，所述過(guò)表達(dá)的方法為將zmphr1蛋白的編碼基因?qū)胧荏w植物中。

67、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明最后提供了一種培育抗旱性降低和/或蒸騰速率提高和/或氣孔導(dǎo)度提高和/或氣孔開(kāi)度提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

68、本發(fā)明提供的培育抗旱性降低和/或蒸騰速率提高和/或氣孔導(dǎo)度提高和/或氣孔開(kāi)度提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括如下步驟：降低受體植物中zmphr1蛋白的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性低于所述受體植物，蒸騰速率和/或氣孔導(dǎo)度和/或氣孔開(kāi)度高于所述受體植物。

69、進(jìn)一步的，所述降低受體植物中zmphr1蛋白的含量和/或活性的方法為將上述抑制zmphr1蛋白活性的物質(zhì)或抑制編碼zmphr1蛋白基因表達(dá)的物質(zhì)或敲除編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)導(dǎo)入受體植物中。

70、更進(jìn)一步的，所述敲除編碼zmphr1蛋白基因的物質(zhì)為敲除編碼zmphr1蛋白基因的載體。

71、上述任一所述應(yīng)用或方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述zmphr1基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

72、上述任一所述應(yīng)用或方法中，所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物，包括但不限于玉米、水稻、小麥、棉花或大豆。優(yōu)選地，所述單子葉植物為禾本科植物。更優(yōu)選地，所述禾本科植物為玉米。

73、本發(fā)明通過(guò)對(duì)zmphr1過(guò)表達(dá)玉米株系和zmphr1突變體的抗旱性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在正常澆水時(shí)，zmphr1過(guò)表達(dá)玉米株系的生長(zhǎng)情況和野生型相似，沒(méi)有顯著區(qū)別，在干旱條件下，zmphr1過(guò)表達(dá)玉米株系在干旱條件下的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于野生型，葉片含水量顯著高于野生型(提高了38％-62％)，同時(shí)葉片萎蔫程度、蒸騰速率(降低了28.57％)、氣孔導(dǎo)度(降低了32.21％)和氣孔開(kāi)度(降低了15.87％)均顯著降低，尤其在aba存在時(shí)，zmphr1過(guò)表達(dá)玉米株系的氣孔開(kāi)度比野生型玉米植株降低了42.42％，而zmphr1突變體的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和氣孔開(kāi)度均顯著高于野生型。說(shuō)明zmphr1蛋白可正調(diào)控植物抗旱性，能通過(guò)aba信號(hào)途徑調(diào)控玉米抵抗干旱脅迫，可通過(guò)提高zmphr1基因的表達(dá)量，有效減少植物的水分流失，提高植物的抗旱性。本發(fā)明提供的抗旱植物的培育方法與傳統(tǒng)育種方式相比具有育種時(shí)間短、目的性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，顯著縮短了育種周期，提高了育種效率。zmphr1的抗旱功能的發(fā)現(xiàn)不僅為培育抗旱植物新品種提供了新的基因靶點(diǎn)和資源，也為闡明植物干旱逆境信號(hào)應(yīng)答的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)