本發(fā)明涉及一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的引物探針組、試劑盒及應(yīng)用，涉及食品檢測。

背景技術(shù)：

1、熱噬淀粉芽孢桿菌為bacillus屬的革蘭氏陰性細(xì)菌，具有極強(qiáng)的耐熱性，其不僅能夠在食品原料和原奶中存活，而且也能夠存活于滅菌的成品牛乳和其他乳制品中。熱噬淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生脂肪分解酶和β-半乳糖苷酶，這可能會導(dǎo)致乳制品的腐敗和酸化。因此，對熱噬淀粉芽孢桿菌進(jìn)行檢測尤為重要，如何對熱噬淀粉芽孢桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對熱噬淀粉芽孢桿菌基因組中負(fù)責(zé)編碼胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，設(shè)計了引物探針組，并基于該引物探針組建立了熒光定量pcr檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)熱噬淀粉芽孢桿菌的特異性檢測，并且較好的重復(fù)性和較高的靈敏度。

2、本發(fā)明還提供一種包括上述引物探針組的試劑盒，以及該引物探針組和試劑盒在檢測熱噬淀粉芽孢桿菌中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明第一方面提供一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的引物探針組，包括第一引物、第二引物和探針；

4、所述第一引物的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；

5、所述第二引物的核苷酸序列如seq?id?no:2所示；

6、所述探針的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

7、在一種具體實(shí)施方式中，所述探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)，所述探針的3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)。

8、在一種具體實(shí)施方式中，所述熒光報告基團(tuán)為fam，所述熒光淬滅基團(tuán)為nfq。

9、本發(fā)明第二方面提供上述任一所述的引物探針組在制備檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明第三方面提供一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的試劑盒，包括上述任一所述的引物探針組。

11、在一種具體實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照；

12、所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含有目的基因的重組質(zhì)粒，所述目的基因的geneid為72730835；所述空白對照為無酶水。

13、本發(fā)明第四方面提供上述引物探針組或上述任一所述的試劑盒在檢測熱噬淀粉芽孢桿菌中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明第五方面提供一種檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的方法，包括如下步驟：

15、步驟1、提取待測樣品的dna；

16、步驟2、使用上述任一所述的引物探針組或者上述任一所述的試劑盒對待測樣品的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線獲取待測樣品的ct值；同時，采用相同的方法對陽性標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線分別獲取陽性標(biāo)準(zhǔn)品的ct值和空白對照的ct值；

17、步驟3、當(dāng)所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品的ct值≤35且所述空白對照的ct值＞35時，則判斷待測樣品的擴(kuò)增結(jié)果有效；

18、當(dāng)待測樣品的ct值≤35時，則判定待測樣品中含有熱噬淀粉芽孢桿菌，當(dāng)ct值＞35時，則判定待測樣品中不含有熱噬淀粉芽孢桿菌。

19、在一種具體實(shí)施方式中，所述方法還包括：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將所述待測樣品的ct值代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計算，獲取待測樣品中熱噬淀粉芽孢桿菌的濃度，具體包括如下步驟：

20、以熱噬淀粉芽孢桿菌的dna為模板，擴(kuò)增得到目的基因，所述目的基因的geneid為72730835；

21、將所述目的基因連接到質(zhì)粒上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，將測序無誤的重組質(zhì)粒配置得到一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，并計算標(biāo)準(zhǔn)品中重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)；

22、使用上述任一所述的引物探針組或者上述任一所述的試劑盒對一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線獲取一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的ct值；

23、以ct值為縱坐標(biāo)，重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

24、在一種具體實(shí)施方式中，所述pcr擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性階段：95℃，3分鐘；變性：95℃，5秒；退火和延伸：60℃，40秒；重復(fù)變性至退火和延伸步驟共40個循環(huán)。

25、本發(fā)明提供的引物探針組以及基于該引物探針組建立的熒光定量pcr檢測方法具有較高的特異性以及較好的穩(wěn)定性，并且靈敏度可以達(dá)到16.7pg/μl，適用于熱噬淀粉芽孢桿菌的檢測。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的引物探針組，其特征在于，包括第一引物、第二引物和探針；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組，其特征在于，所述探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)，所述探針的3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物探針組，其特征在于，所述熒光報告基團(tuán)為fam，所述熒光淬滅基團(tuán)為nfq。

4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的引物探針組在制備檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

5.一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的引物探針組。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品和空白對照；

7.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的引物探針組或權(quán)利要求5～6任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測熱噬淀粉芽孢桿菌中的應(yīng)用。

8.一種檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將所述待測樣品的ct值代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計算，獲取待測樣品中熱噬淀粉芽孢桿菌的濃度，具體包括如下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性階段：95℃，3分鐘；變性：95℃，5秒；退火和延伸：60℃，40秒；重復(fù)變性至退火和延伸步驟共40個循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的引物探針組、試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明第一方面提供一種用于檢測熱噬淀粉芽孢桿菌的引物探針組，包括第一引物、第二引物和探針；第一引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；第二引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。本發(fā)明提供的引物探針組以及基于該引物探針組建立的熒光定量PCR檢測方法具有較高的特異性以及較好的穩(wěn)定性，并且靈敏度可以達(dá)到16.7pg/μL，適用于熱噬淀粉芽孢桿菌的檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：陳勝,蔣晶君,謝瑞龍,劉麗君,徐紅,李翠枝,呂志勇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28