本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是針對(duì)一種基于多重輸入級(jí)聯(lián)反應(yīng)的質(zhì)粒消除模塊。

背景技術(shù)：

1、游離型質(zhì)粒當(dāng)使用基因組編輯或基因電路質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)基因組編輯或基因電路設(shè)計(jì)目的后，搭載在質(zhì)粒上的基因組編輯工具或基因電路就成了細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定因素，此時(shí)需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行消除。

2、溫敏復(fù)制子質(zhì)粒消除效率偏低，服務(wù)多種質(zhì)粒則可能加劇質(zhì)粒的自發(fā)丟失，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)工作的開(kāi)展；基于sacb基因質(zhì)粒消除能同時(shí)服務(wù)于多個(gè)質(zhì)粒，無(wú)法準(zhǔn)確的消除特定種類(lèi)的質(zhì)粒，且其對(duì)突變的耐受能力較弱，容易出現(xiàn)失效的情況；crispr蛋白相關(guān)質(zhì)粒消除?；赾rispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)存在crispr蛋白基因突變失效或crispr蛋白切割脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，且crispr相關(guān)蛋白元件基因序列較長(zhǎng)，不利于在難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤(pán)微生物中使用。當(dāng)?shù)妆P(pán)細(xì)胞內(nèi)無(wú)天然crispr蛋白可利用時(shí)，需要額外的轉(zhuǎn)入帶有crispr蛋白的質(zhì)粒，而帶crispr蛋白的質(zhì)粒自靶向消除失敗率較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提出了一種基于反義rna的質(zhì)粒消除技術(shù)，設(shè)計(jì)了質(zhì)粒消除模塊，該模塊能促進(jìn)細(xì)胞中自發(fā)丟失率較低的游離型質(zhì)粒發(fā)生丟失，能高效實(shí)現(xiàn)多種游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，能應(yīng)用于真核、原核細(xì)胞中的不同種類(lèi)(拷貝數(shù))游離型質(zhì)粒的選擇消除或同步消除，對(duì)于序列突變的耐受性優(yōu)于基于crispr蛋白的質(zhì)粒消除技術(shù)。相關(guān)蛋白元件基因序列長(zhǎng)度小于crispr，對(duì)于難以轉(zhuǎn)入大質(zhì)粒的底盤(pán)細(xì)胞依然適用。

2、針對(duì)代謝關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)的反義rna，可以降低該代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)速率。在細(xì)胞擴(kuò)增和傳代時(shí)，質(zhì)粒隨機(jī)分配到子代，含有這種消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞數(shù)量會(huì)越來(lái)越少，不含有該消除模塊的質(zhì)粒的子代細(xì)胞因生長(zhǎng)迅速會(huì)變得越來(lái)越多，從而達(dá)到富集無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除的目的。

3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊，除反義rna表達(dá)區(qū)域須部署在待消除質(zhì)粒上以外，其余區(qū)域部署于待消除質(zhì)粒所在的細(xì)胞內(nèi)即可。完成部署后，本發(fā)明設(shè)計(jì)的質(zhì)粒消除模塊可在部署范圍內(nèi)高效的實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒消除。

4、本發(fā)明的意義在于提出了一種便捷可用、可編程、適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、所需序列較短的通用的質(zhì)粒消除模塊構(gòu)建思路，在滿足前置條件的情況下，該質(zhì)粒消除模塊可用于基因工程菌構(gòu)建后的構(gòu)建質(zhì)粒消除、人工構(gòu)建的質(zhì)粒消除，也可搭配序列編輯工具實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)天然質(zhì)粒的消除。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

6、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，包括四類(lèi)相互獨(dú)立的表達(dá)區(qū)域，第一類(lèi)區(qū)域?yàn)榉戳xrna表達(dá)區(qū)域，包括反義rna、反義rna的組成型啟動(dòng)子及終止子；所述反義rna為代謝關(guān)鍵基因mrna的反義rna，能與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合阻礙代謝關(guān)鍵基因mrna翻譯的rna片段；第二類(lèi)區(qū)域?yàn)榈谝环戳x中和rna表達(dá)區(qū)域，包括第一反義中和rna的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或含有組成型啟動(dòng)子與阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)的片段、第一反義中和rna序列、第一接頭序列及終止子；第三類(lèi)區(qū)域?yàn)榈诙戳x中和rna表達(dá)區(qū)域，包括第二反義中和rna的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或含有組成型啟動(dòng)子與阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)的片段、第二接頭序列、第二反義中和rna序列以及終止子；所述第一反義中和rna和第二反義中和rna是能通過(guò)接頭實(shí)現(xiàn)非共價(jià)鏈接形成完整的反義中和rna并能結(jié)合反義rna，使之無(wú)法與代謝關(guān)鍵基因mrna結(jié)合并抑制反義rna對(duì)代謝關(guān)鍵基因mrna產(chǎn)生翻譯阻礙的rna片段；第四類(lèi)區(qū)域?yàn)樽瓒舻鞍谆?轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)區(qū)域，包括阻遏蛋白基因自帶的組成型啟動(dòng)子，其包括rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、阻遏蛋白翻譯區(qū)/轉(zhuǎn)錄因子自帶的組成型啟動(dòng)子，其包括rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子翻譯區(qū)、終止子。

7、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的反義rna使用組成型啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；組成型啟動(dòng)子包括t7、tet、trc、trp、j23119啟動(dòng)子、tac以及谷氨酸桿菌常用抗生素氯霉素、卡那霉素抗性基因相關(guān)的的組成型啟動(dòng)子；終止子為rrnb?t1、rrnb?t2或cyc1終止子。

8、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子為能與特定化合物結(jié)合后，誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)下游基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)；或未與特定化合物結(jié)合前能誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄，與特定化合物結(jié)合后無(wú)法誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)下游基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。

9、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反義中和rna誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的片段為阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子以及阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子，其包括阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子與阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

10、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的第一反義中和rna和第二反義中和rna的啟動(dòng)子包括t7、tef1、j23119啟動(dòng)子、tet、trc、trp、tac以及谷氨酸桿菌常用抗生素氯霉素、卡那霉素抗性基因相關(guān)的的組成型啟動(dòng)子、met17以及阿拉伯糖啟動(dòng)子，所述第一反義中和rna和第二反義中和rna的終止子包括cyc1、rrnb?t1或t7終止子；所述第一反義中和rna和第二反義中和rna轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)條件不同。

11、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的阻遏蛋白為能與特定dna序列結(jié)合、結(jié)合后能抑制下游dna轉(zhuǎn)錄、能被特定化合物激活或解除結(jié)合活性且不影響底盤(pán)細(xì)胞生長(zhǎng)的阻遏蛋白，所述的阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)與阻遏蛋白結(jié)合，并阻礙rna聚合反應(yīng)通過(guò)或越過(guò)結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)下游dna序列。

12、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的阻遏蛋白基因?yàn)閘aci基因，所述阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)為laci蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

13、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的待消除質(zhì)粒包括pet28a、pec-xk99e、酵母2μ中任意一項(xiàng)。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述的代謝關(guān)鍵基因?yàn)閠ca循環(huán)相關(guān)基因、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、有氧呼吸相關(guān)基因、無(wú)氧呼吸相關(guān)基因、脂質(zhì)合成相關(guān)基因、細(xì)胞壁合成相關(guān)基因、糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)基因、atp合成相關(guān)基因、細(xì)胞骨架合成相關(guān)基因、nadph/nadp+合成相關(guān)基因、nadh/nad+合成相關(guān)基因、維生素合成相關(guān)基因、一碳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因、二氧化碳固定相關(guān)基因、dna/rna合成相關(guān)基因、氨基酸合成相關(guān)基因、核糖合成相關(guān)基因、核糖體合成相關(guān)基因、核糖體組裝相關(guān)基因、氨酰trna合成酶相關(guān)基因及上述基因的同工酶基因。

15、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述質(zhì)粒消除模塊的消除對(duì)象為所有具備穩(wěn)定游離質(zhì)粒、游離質(zhì)粒有一定概率不會(huì)分配給子細(xì)胞、且游離質(zhì)粒消除后不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或無(wú)法增殖的微生物、動(dòng)物或植物細(xì)胞。

16、大腸桿菌相關(guān)序列：

17、大腸桿菌acnb基因干擾區(qū)全序列：

18、actatgacaatgagagcgaggagaaccgtcgtgctagaagaataccgtaagcacg(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

19、gaaaaagccgatggggtgattttccagactgcggtttaa(seq?id?no：1)

20、pet28a質(zhì)粒全序列：

21、tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtta(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

22、gttttttgctgaaaggaggaactatatccggat(seq?id?no：2)

23、阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：

24、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

25、gcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?id?no：3)

26、t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：

27、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：4)

28、阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：

29、ggatttctgttcatgggggtaatgataccgatggcgcacatttccccgaaaagtgcc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

30、gacaaaaacgcgtaacaaaagtgtct(seq?id?no：5)

31、j23119啟動(dòng)子：

32、ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc→(seq?id?no：6)

33、tet啟動(dòng)子：

34、ttgacagcttatcatcgattagctttaat→(seq?id?no：7)

35、rrnb?t1終止子：

36、caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctc(seq?id?no：8)

37、laci蛋白表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：

38、gacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaaga(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

39、taagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagcc(seq?id?no：9)

40、谷氨酸棒桿菌acn基因cds區(qū)全序列：

41、ttggagctcactgtgactgaaagcaagaactccttcaatgctaagagcacccttga(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

42、cagatggctgcttcttctaagtaa(seq?id?no：10)

43、谷氨酸棒桿菌pec-xk99e質(zhì)粒序列：

44、gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagct(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

45、gataacaatttcacacaggaaacagaccatg(seq?id?no：11)

46、阿拉伯糖啟動(dòng)子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄起始方向)：

47、aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

48、gcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat→(seq?id?no：12)

49、t7終止子序列(箭頭為轉(zhuǎn)錄終止方向)：

50、→ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq?id?no：13)

51、阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)：

52、agacacttttgttacgcgtttttgtcatggctttggtcccgctttgttacagaatgc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

53、cccccatgaacagaaatcc(seq?id?no：14)

54、laci蛋白表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、cds區(qū)、終止子)

55、gacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaaga(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

56、gataatgttttttgcgccgacatcataacggttctg(seq?id?no：15)

57、trc啟動(dòng)子：

58、ttgacaattaatcatccggctcgtataatg→(seq?id?no：16)

59、rrnb?1終止子：

60、→

61、caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtc?ggtgacgtctcctgagtaggacaaat(seq?id?no：17)

62、rrnb?t2終止子：

63、→agaaggccatcctgacggatggcctttt(seq?id?no：18)

64、釀酒酵母相關(guān)序列：

65、釀酒酵母aco1/glu1基因cds區(qū)全序列：

66、atgctgtctgcacgttctgccatcaagagacccattgttcgtggtcttgcgacagtc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

67、ggccgatgagaagaaataa(seq?id?no：19)

68、釀酒酵母2u穿梭質(zhì)粒序列：

69、caactttgtatagaaaagttgacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

70、ccgctacagggcgcgtggggatcgatccactagt(seq?id?no：20)

71、釀酒酵母硫酸新霉素抗性基因序列(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：

72、gtgagttgagtatacatgcatttacttataatacagtttttcagaagaactcgtcaa(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

73、gtctgtgctccttccttcgttcttccttctg(seq?id?no：21)

74、穿梭載體大腸桿菌復(fù)制子序列：

75、tttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcaga(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

76、gcagaaaaaaaggatctcaa(seq?id?no：22)

77、穿梭載體氨芐青霉素抗性基因表達(dá)框(包含啟動(dòng)子、表達(dá)框、終止子)：

78、ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtat(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

79、agctctaatttgtgagttgagtatacatgc(seq?id?no：23)

80、釀酒酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子met17序列：

81、ttattttttgctttttctcttgaggtcacatgatcgcaaaatggcaaatggcacgtgaag(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

82、tcgtcagatacatagatacaattctattacccccatccataca→(seq?id?no：24)酵母終止子cyc1序列：

83、→

84、atcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccg(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

85、ctcgaaggctttaatttgcaagct(seq?id?no：25)

86、釀酒酵母用laci蛋白cds區(qū)序列：

87、atgaaaccagttactttgtatgatgttgctgaatatgctggtgtttcttatcaaactgttt(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

88、atgcaattggctagacaagtttctagattggaatctggtcaatga(seq?id?no：26)釀酒酵母組成型啟動(dòng)子tef1序列：

89、ccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggac(此處省略，詳見(jiàn)序列表)

90、cttcttgctcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaag→(seq?id?no：27)

91、釀酒酵母組成型啟動(dòng)子gap序列：

92、tttttgtagaaatgtcttggtgtcctcgtccaatcaggtagccatctctgaaatatctggc(此處省略，詳見(jiàn)序列表)ttgtccctatttcaatcaattgaacaactat→(seq?id?no：28)

93、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于反義rna的、模塊化的質(zhì)粒消除技術(shù)，構(gòu)建質(zhì)粒消除模塊所需元件簡(jiǎn)單易得，質(zhì)粒模塊消除效率高，可根據(jù)需要自由設(shè)置消除對(duì)象，可實(shí)現(xiàn)多種質(zhì)粒的選擇性或同步消除。且本發(fā)明應(yīng)用范圍廣，真核原核生物中均可應(yīng)用該技術(shù)，中心代謝途徑相關(guān)基因皆可結(jié)合反義rna用于質(zhì)粒消除，中心代謝途徑之外的氨基酸、核酸、脂質(zhì)合成途徑、轉(zhuǎn)錄翻譯、dna復(fù)制、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等代謝相關(guān)基因的反義rna同樣可應(yīng)用于本技術(shù)，若消除效果不佳還可通過(guò)增加反義rna種類(lèi)、延長(zhǎng)反義rna長(zhǎng)度等策略強(qiáng)化消除效果。