本發明涉及的是一種生物醫藥領域的技術，具體是一種膿腫分枝桿菌及海洋分枝桿菌疫苗及其制備方法。

背景技術：

1、分枝桿菌是一組多樣化的細菌，其特征在于它們引起疾病的能力不同。分枝桿菌分為非結核分枝桿菌(ntm)和引起結核病的分枝桿菌。ntm是無處不在的、異構的，并導致肺部感染、播散性感染、頸部淋巴結炎以及骨骼和軟組織感染。ntm感染在世界范圍內正在增加，在許多國家已經超過了結核病的發病率。年齡、支氣管擴張、暴露于氣溶膠、不分青紅皂白地使用抗生素和免疫抑制劑、使用淋浴和人類與病原體的相互作用，再加上診斷能力的提高是ntm誘發疾病發病率增加的原因。治療ntm的費用很高。長期治療、廣泛的抗生素耐藥性、感染復發和缺乏合適的疫苗已成為一個令人擔憂的問題。

技術實現思路

1、本發明針對現有技術無法提供對非結核分枝桿菌感染的保護以及更有效刺激機體產生對抗分枝桿菌炎癥因子的不足，提出一種膿腫分枝桿菌及海洋分枝桿菌疫苗及其制備方法，通過將來源于海洋分枝桿菌的細胞壁抗原蛋白mmar_1296，在無任何毒力的恥垢分枝桿菌msmeg疫苗載體的表面展示，構建重組菌株及其疫苗，通過亞細胞組分分離和western-blot實驗證明抗原蛋白mmar_1296成功被展示在恥垢分枝桿菌mc2155表面；通過balb/c小鼠體內實驗證明表面展示mmar_1296抗原蛋白的重組恥垢分枝桿菌疫苗的免疫效果遠遠優于卡介苗疫苗bcg。

2、本發明是通過以下技術方案實現的：

3、本發明涉及一種重組的恥垢分枝桿菌(mycobacteriμm?smegmatis)，其包含基于抗原蛋白基因的重組質粒，用于穩定表達細胞壁抗原蛋白。

4、所述的重組質粒，按順時針方向依次含有重組質粒按順時針方向依次含有抗性篩選基因kan、大腸桿菌復制子orie、啟動子hsp60、抗原蛋白基因mmar_1296、基因標簽flag-tag，其中：啟動子hsp60的dna序列如seq?id?no.1所示；抗原蛋白基因mmar_1296的序列如seq?id?no.2所示；基因標簽flag-tag的dna序列如seq?id?no.3所示。

5、所述的重組，通過電轉化法重組質粒轉入恥垢分枝桿菌mc2155中得到。

6、所述的抗原蛋白基因，具體為mmar_1296，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

7、所述的重組質粒，通過以下方式制備得到：構建質粒pmv261-mmar_1296：起始質粒pmv261用限制性內切酶ecorv消化后，回收約5kb的功能片段a；以海洋分枝桿菌的基因組為模板，分別用引物mmar_1296-f與引物mmar_1296-r擴增出199bp的片段mmar_1296，mmar_1296經同源重組酶功能片段a進行連接，得到約4.7kb的質粒pmv261-mmar_1296。

8、所述的引物mmar_1296-f與引物mmar_1296-r序列依次分別如seq?id?no.4和seqid?no.5所示。

9、本發明涉及一種基于上述重組的恥垢分枝桿菌的應用，將其用于制備疫苗。

10、所述的制備，具體包括：將作為空載體的恥垢分枝桿菌mc2155、市售由減毒牛型結核桿菌懸浮液制成的卡介苗(bcg)、上述制備得到的重組的恥垢分枝桿菌培養得到菌液并乳化后用于注射。

11、技術效果

12、本發明通過含有hsp60強啟動子的游離型質粒pmv261融合表達未被解析功能的海洋分枝桿菌膜蛋白mmar_1296以構建重組恥垢分枝桿菌。相比現有技術，本發明制備得到的重組恥垢分枝桿菌能夠更有效提供對膿腫分枝桿菌和海洋分枝桿菌感染的保護。

技術特征：

1.一種重組的恥垢分枝桿菌(mycobacteriμm?smegmatis)，其特征在于，包含基于抗原蛋白基因的重組質粒，用于穩定表達細胞壁抗原蛋白；

2.根據權利要求1所述的重組的恥垢分枝桿菌，其特征是，所述的重組，通過電轉化法重組質粒轉入恥垢分枝桿菌mc2155中得到。

3.根據權利要求1所述的重組的恥垢分枝桿菌，其特征是，所述的抗原蛋白基因，具體為mmar_1296，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4.根據權利要求1所述的重組的恥垢分枝桿菌，其特征是，所述的重組質粒，通過以下方式制備得到：構建質粒pmv261-mmar_1296：起始質粒pmv261用限制性內切酶ecorv消化后，回收約5kb的功能片段a；以海洋分枝桿菌的基因組為模板，分別用引物mmar_1296-f與引物mmar_1296-r擴增出199bp的片段mmar_1296，mmar_1296經同源重組酶功能片段a進行連接，得到約4.7kb的質粒pmv261-mmar_1296。

5.根據權利要求4所述的重組的恥垢分枝桿菌，其特征是，所述的引物mmar_1296-f與引物mmar_1296-r序列依次分別如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示。

6.一種基于權利要求1-5中任一所述重組的恥垢分枝桿菌的應用，其特征在于，將其用于制備疫苗。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征是，所述的制備，具體包括：將作為空載體的恥垢分枝桿菌mc2155、市售由減毒牛型結核桿菌懸浮液制成的卡介苗(bcg)、上述制備得到的重組的恥垢分枝桿菌培養得到菌液并乳化后用于注射。

技術總結
一種膿腫分枝桿菌及海洋分枝桿菌疫苗及其制備方法，其包含基于抗原蛋白基因的重組質粒，用于穩定表達細胞壁抗原蛋白，該重組質粒，按順時針方向依次含有重組質粒按順時針方向依次含有抗性篩選基因Kan、大腸桿菌復制子oriE、啟動子hsp60、抗原蛋白基因MMAR_1296、基因標簽Flag?tag，其中：啟動子hsp60的DNA序列如SEQ?ID?No.1所示；抗原蛋白基因MMAR_1296的序列如SEQ?ID?No.2所示；基因標簽Flag?tag的DNA序列如SEQ?ID?No.3所示。本發明通過將來源于海洋分枝桿菌的細胞壁抗原蛋白MMAR_1296，在無任何毒力的恥垢分枝桿菌Msmeg疫苗載體的表面展示，構建重組菌株及其疫苗，通過亞細胞組分分離和western?blot實驗證明抗原蛋白MMAR_1296成功被展示在恥垢分枝桿菌MC<supgt;2</supgt;155表面；通過Balb/c小鼠體內實驗證明表面展示MMAR_1296抗原蛋白的重組恥垢分枝桿菌疫苗的免疫效果遠遠優于卡介苗疫苗BCG。

技術研發人員：王哲,謝煒樂,羅丹
受保護的技術使用者：上海交通大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28