本發明涉及病毒檢測，具體涉及一種快速定量檢測人細小病毒b19的試劑盒、引物探針組合及其應用。

背景技術：

1、人細小病毒b19(parvovirus?b19，簡稱b19病毒)屬于細小病毒科(parvoviridaefamily)，紅病毒屬(erythrovirusgenus)，無包膜，是單鏈線狀dna病毒。人細小病毒b19感染可引起多種疾病，且不同年齡階段或免疫狀態不同的人群感染后的臨床表現有很大差異。免疫力正常的成人感染b19病毒之后通常表現一些輕型自限性的、類似感冒發燒的癥狀，但是對于特殊人群感染b19病毒會導致嚴重疾病，例如接受器官移植手術等處于免疫抑制狀態下的病人感染會導致貧血、純紅細胞再生障礙性貧血癥、慢性貧血癥、發燒、關節痛等。因此，對于細小病毒b19的診斷和監測具有重要的臨床意義。

2、目前，已獲nmpa批準產品的檢測方法為血清學檢測。然而，該檢測方法存在諸多不足，如免疫功能受損、接受免疫抑制治療的人群無法產生抗體，無法采用血清學檢測，無法滿足臨床快速、準確診斷的需求。熒光定量pcr技術因其高靈敏度、高特異性和定量檢測的優勢，已成為病毒檢測的常用方法。然而，在實際應用中，仍存在一些問題影響檢測效果，如擴增效率不高、靈敏度低等。

3、因此，當前急需發展一種靈敏度高、且能夠快速定量檢測人細小病毒b19的方法，以克服血清學檢測無法檢測免疫功能受損、接受免疫抑制治療的人群及傳統熒光定量pcr靈敏度低的不足之處。

技術實現思路

1、為解決上述技術問題，本發明提供了一種快速定量檢測人細小病毒b19的試劑盒、引物探針組合及其應用。

2、具體而言，本發明提供了一種用于快速定量檢測人細小病毒b19的試劑盒，所述試劑盒包括b19引物探針混合液、b19酶混合液和b19?pcr反應液；

3、其中，所述b19?pcr反應液包括pcr增強劑，所述pcr增強劑包括納米材料類pcr增強劑、小分子化學類pcr增強劑和蛋白類pcr增強劑。

4、在一些實施方案中，所述納米材料類pcr增強劑包括石墨烯納米片、金納米顆粒(aunps)、氧化石墨烯(go)、量子點(qds)、上轉換納米粒子(ucnps)和碳納米管(cnts)。

5、在一些實施方案中，所述小分子化學類pcr增強劑包括海藻糖、甜菜堿、二硫蘇糖醇(dtt)、甲酰胺、甘油、丙二醇、dmso、四甲基氯化銨(tmac)、和亞精胺(spermidine)。

6、在一些實施方案中，所述和蛋白類pcr增強劑包括牛血清白蛋白(bsa)、單鏈結合蛋白和牛凝血酶(bt)。

7、在一些具體的實施方案中，所述pcr增強劑包括石墨烯納米片、甜菜堿、海藻糖、bsa和單鏈結合蛋白中的一種或多種。

8、在一些具體的實施方案中，所述pcr增強劑包括0.001-0.01w/w％石墨烯納米片、0.5～3m甜菜堿、0.1-1m海藻糖、0.2-1mg/ml?bsa和1-15ng/μl單鏈結合蛋白中的一種或多種。

9、在一些具體的實施方案中，所述pcr增強劑包括0.01w/w％石墨烯納米片、1.7m甜菜堿、0.5m海藻糖、0.8mg/ml?bsa和5ng/μl單鏈結合蛋白中的一種或多種。

10、在一些實施方案中，所述試劑盒還包括b19陰性質控品、b19弱陽性質控品、b19陽性質控品、b19定量標準品和b19內標質控品中的一種或多種。

11、在一些具體的實施方案中，所述b19弱陽性質控品和所述b19陽性質控品為包含如seq?id?no:1所示的核苷酸序列的假病毒顆粒；所示b19內標質控品為包含如seq?id?no:2所示的核苷酸序列的質粒。

12、在一些具體的實施方案中，所述b19引物探針混合液包括核苷酸序列如seq?idno:3所示的上游引物b19-f、核苷酸序列如seq?id?no:4所示的下游引物b19-r和核苷酸序列如seq?id?no:5所示的探針b19-p。

13、在一些實施方案中，所述b19引物探針混合液還包括檢測內參的引物探針。

14、在一些具體的實施方案中，所述檢測內參的引物探針包括核苷酸序列如seq?idno:6所示的上游引物nc-f、核苷酸序列如seq?id?no:7所示的下游引物nc-r和核苷酸序列如seq?id?no:8所示的探針nc-p。

15、在一些具體的實施方案中，所述探針的5’端標記有熒光染料fam、vic、rox、cy5中的任意一種，所述探針的3’端均標記有淬滅熒光染料bhq。

16、在一些實施方案中，所述b19?pcr反應液還包含5×hotstart?taq?pcr?buffer、datp、dgtp、dctp、dttp和dutp中的一種或多種。

17、在一些具體的實施方案中，所述b19?pcr反應液還包含5×hotstart?taq?pcrbuffer、100-600μmdatp、100-600μm?dgtp、100-600μm?dctp、50-300μm?dttp和50-300μmdutp。

18、在一些具體的實施方案中，所述b19?pcr反應液還包含5×hotstart?taq?pcrbuffer、200μm?datp、200μm?dgtp、200μm?dctp、200μm?dttp和200μm?dutp。

19、在一些實施方案中，所述b19酶混合液包含hotstart?taq?dna?polymerase和uracil?dna?glycosylase,heat-labile。

20、在一些具體的實施方案中，所述b19酶混合液包含0.005-0.5u/μl?hotstart?taqdnapolymerase和0.005-0.5u/μl?uracil?dnaglycosylase,heat-labile。

21、在一些具體的實施方案中，所述b19酶混合液包含0.1u/μl?hotstart?taq?dnapolymerase和0.04u/μl?uracil?dna?glycosylase,heat-labile。

22、本發明還提供了一種引物探針組合，所述引物探針組合還包括檢測內參的引物探針。

23、在一些具體的實施方案中，所述檢測內參的引物探針包括核苷酸序列如seq?idno:6所示的上游引物nc-f、核苷酸序列如seq?id?no:7所示的下游引物nc-r和核苷酸序列如seq?id?no:8所示的探針nc-p。

24、在一些具體的實施方案中，所述探針的5’端標記有熒光染料fam、vic、rox、cy5中的任意一種，所述探針的3’端均標記有淬滅熒光染料bhq。

25、本發明還提供了一種快速定量檢測人細小病毒b19的方法，所述方法包括以下步驟：

26、使用所述的試劑盒或所述的引物探針組合對待測樣本進行pcr檢測。

27、在一些實施方案中，所述待測樣本為含基因組dna的生物樣本。

28、在一些具體的實施方案中，所述待測樣本為全血或口腔黏膜脫落細胞。

29、在一些具體的實施方案中，所述pcr檢測的反應條件為：37℃udg酶反應2min，95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃退火延伸30s，共45個循環。

30、本發明還提供了所述的試劑盒或所述的引物探針組合在檢測人細小病毒b19中的應用；其中，所述應用為非診斷和治療目的的。

31、本發明還提供了一種快速定量檢測人細小病毒b19的方法，所述方法結合小分子化學類、納米材料類及蛋白類pcr增強劑提高b19病毒核酸檢測的靈敏度。

32、在一些具體的實施方案中，所述方法包括以下步驟：

33、(1)第一步設計特異性引物和探針：根據人細小病毒b19的1、2、3三種基因型的基因序列，設計特異性引物(b19-f和b19-r)和熒光探針(b19-p)。針對小球藻基因設計特異性引物(nc-f和nc-r)和熒光探針(nc-p)，將其作為內標引物和探針。

34、(2)所述人細小病毒b19核酸靶基因序列如下

35、tccacccagacctccaaaccaccccaattgtcacagacaccagtatcagcagcagtggtggtgaaagctctgaagaactcagtgaaagcagc(seq?id?no:1)

36、(3)所述內標基因靶基因序列如下

37、accttgaagtggcacagcgtggtcaagatctctcagagcttgtaccgggaggcacctggcg?tggaccccttccgcccagaccagcgcacccccgtccccaacttcttcct(seq?id?no:2)

38、(4)所述特異性識別b19核酸引物探針序列如下：

39、表1b19核酸擴增引物探針序列

40、 名稱 序列 b19-f cacccagayctccaaacc(seq?id?no:3) b19-r gctgctttcactgagttsttc(seq?id?no:4) b19-p 5’fam-ccagtrtcagcagcagtggtggtgaa-3’bhq1(seq?id?no:5)

41、(5)所述特異性識別內標基因的引物探針序列如下：

42、表2內標擴增引物探針序列

43、

44、

45、(6)第二步制備人細小病毒b19擴增體系，擴增體系中包括b19核酸特異性結合的引物b19-f、b19核酸特異性引物b19-r、b19核酸特異性探針b19-p、內標特異性引物nc-f、內標特異性引物nc-r、內標特異性探針nc-p、脫氧腺苷三磷酸(datp)、脫氧鳥苷三磷酸(dgtp)、脫氧胞苷三磷酸(dctp)、脫氧胸苷三磷酸(dttp)、脫氧尿苷三磷酸(dutp)、5×hotstart?taq?pcr?buffer、pcr增強劑、hotstart?taq?dna?polymerase和uracil?dnaglycosylase,heat-labile。

46、(7)所述pcr增強劑是經過大量實驗篩選和優化得到的，包含納米材料類、小分子化學類和蛋白類pcr增強劑。

47、(8)所述納米材料類pcr增強劑包含石墨烯納米片，具有獨特的物理化學性質，添加石墨烯納米片的pcr緩沖液會增強導熱性，從而使dna，taq?dna聚合酶和其他試劑之間的相互作用更加有效。所述小分子化學類pcr增強劑包含甜菜堿和海藻糖，甜菜堿可幫助dna聚合酶順利通過dna某些復雜二級結構，防止dna聚合酶的從模板dna中解離，高濃度的甜菜堿溶液可穩定dna-蛋白復合物。海藻糖可通過保護酶免受血液抑制劑的干擾而起作用。所述蛋白類增強劑包含bsa和單鏈結合蛋白，bsa可結合核酸提取過程中殘留的化合物，保護taqdna聚合酶活性，從而起到增強pcr擴增效率的作用。在pcr過程中，dna雙鏈解旋形成單鏈，單鏈結合蛋白可以與這些單鏈dna迅速結合，防止單鏈dna重新形成雙鏈，從而保持單鏈狀態的穩定性，為引物的結合和后續的擴增提供了有利條件，單鏈結合蛋白可以與dna聚合酶相互作用，優化其在單鏈模板上的移動和催化作用，從而增強dna聚合酶的活性，加快dna合成的速度，單鏈結合蛋白可以減少單鏈dna被核酸酶攻擊和降解的風險，保證模板的完整性，有助于pcr反應的順利進行。

48、(9)所述人細小病毒b19的pcr擴增體系進一步包含一種或多種以下組分：5×hotstart?taq?pcr?buffer、100-600μm?datp、100-600μm?dgtp、100-600μm?dctp、50-300μmdttp、50-300μm?dutp、0.1-0.4μm的引物(b19-f、b19-r、nc-f和nc-r)、0.05-0.2μm的探針(b19-p和nc-p)、0.005-0.5u/μl?hotstart?taq?dna?polymerase和0.005-0.5u/μl?uracildna?glycosylase,heat-labile、0.001-0.01w/w％石墨烯納米片、0.5～3m甜菜堿、0.1-1m海藻糖、0.2-1mg/ml?bsa、1-15ng/μl單鏈結合蛋白。pcr檢測分裝體積為20-45μl。

49、(10)第三步制備定量標準品b19定量標準品ⅰ～ⅳ、b19內標質控品、b19陰性質控品、b19陽性質控品和b19臨界陽性質控品。所述定量標準品b19定量標準品ⅰ～ⅳ溯源至3rdwho?international?standard?for?parvovirus?b19?for?nucleicacid?amplificationtechniques(nibsc?code:12/208)，為包含b19靶基因序列的質粒。所述b19內標質控品為包含內標基因序列的質粒。所述b19陰性質控品為純化水。所述b19陽性質控品和b19臨界陽性質控品為包含b19靶基因序列的假病毒顆粒。

50、(11)所述b19陰性質控品為純化水。所述b19陽性質控品和b19弱陽性質控品包含終濃度分別為5×104～5×105iu/ml和200～1000iu/ml的包含靶基因序列的b19假病毒。所述b19定量標準品1-4包含終濃度分別為1×107～3×107iu/ml、1×106～3×106iu/ml、1×105～3×105iu/ml和1×104～3×104iu/ml的質粒。

51、(12)第四步提取待測樣本、質控品及定量標準品中的核酸：待測樣本與陰性質控品、陽性質控品、弱陽性質控品和定量標準品1～4各取100-200μl同步進行核酸提取，核酸提取前均先分別加入5-10μl內標質控品。

52、(13)第五步加樣：在人細小病毒b19的pcr擴增體系加入5-30μl提取的核酸。pcr終體積為25-50μl。

53、(13)第六步實時熒光定量pcr檢測：進行實時熒光定量pcr檢測，根據標準曲線計算樣本中b19病毒的含量。

54、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。

55、本發明所用試劑和原料均市售可得。

56、本發明的積極進步效果在于：

57、1.靈敏度高：本發明利用各種pcr增強劑提升擴增效率，提高檢測靈敏度，本發明的試劑盒能夠檢測到低至100iu/ml的病毒核酸，有助于早期診斷。

58、2.操作簡便：本發明的檢測方法基于常規的實時熒光定量pcr技術，操作流程簡單，易于在臨床實驗室推廣應用。

59、3.適用人群廣：本發明的檢測方法可用于免疫功能受損、接受免疫抑制治療等人群的b19病毒感染的輔助診斷。