本發明涉及微生物，具體地說，涉及一種重組酵母菌及其在發酵生產β-欖香烯中的應用。

背景技術：

1、β-欖香烯是中藥溫郁金的有效成分之一，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性。目前臨床上廣泛應用β-欖香烯注射液治療肺癌、肝癌、食道癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤，具有毒副作用小，對正常細胞和周圍白細胞影響較小的特點，且有助于化療、放療藥物進入癌組織發揮作用。

2、隨著β-欖香烯市場需求的不斷增加，利用傳統的提取分離方法從天然植物溫郁金中獲得β-欖香烯已無法滿足市場需求，且通過提取分離得到的產品存在得率少、純度低等問題，二次分離所需成本高。而通過化學合成的方法合成β-欖香烯，需要用到如二氯甲烷、氰化鈉、甲苯等劇毒化學試劑，不利于環境保護；且化學合成的反應條件較難達到，而產品得率也很低。

3、隨著生物技術的發展，合成生物學受到越來越多的關注。通過在微生物底盤細胞中重組天然化合物的生物合成途徑，來快速、大量的獲取天然產物及其中間體，為植物天然活性產物的開發與應用提供了新的方法。微生物具有生長速度快、發酵周期短、發酵成本低的優點，且相對于植物其遺傳背景更清楚，有利于遺傳改造。因此有必要對如何構建可高效發酵生產β-欖香烯的重組菌進行研究。

技術實現思路

1、本發明的目的之一在于提供一種新的重組酵母菌及其在發酵生產β-欖香烯中的應用。

2、本發明提供了一種重組酵母菌，其與出發酵母菌株相比，表達法尼基二磷酸合酶erg20、萵苣來源的倍半萜合酶lsltc2和玫瑰來源的雙功能法尼基二磷酸合酶rrfps，并在過氧化物酶體中表達idi1、erg13、erg8、erg10、erg12、mvd1和thmgr。

3、本發明特別研究發現，通過在酵母中，表達法尼基二磷酸合酶erg20、特定的外源倍半萜合酶lsltc2和雙功能法尼基二磷酸合酶rrfps，并在過氧化物酶體中進行內源的mva途徑關鍵基因編碼酶的表達，可顯著提升β-欖香烯的發酵產量。

4、優選，通過在酵母基因組上整合多個目標基因的拷貝數，來提升目標蛋白的表達。如，在酵母基因組上整合8個拷貝數的erg20和lsltc2基因（其中2個拷貝整合到酵母染色體的rdna位點，6個拷貝數整合在delta位點上）和6個拷貝數的rrfps基因。

5、優選，本發明的重組酵母菌，與出發酵母菌菌株相比，在細胞基質內還包括以下變化中的一種或多種：

6、（1）鯊烯合酶erg9的表達量下調；

7、（2）過表達erg10和erg13；

8、（3）表達xfpk和pta；

9、（4）過表達idi1；

10、（5）表達poxb和acs。

11、進一步在細胞基質內下調erg9的表達量、或過表達erg10和erg13、或表達xfpk和pta、或過表達idi1、或表達poxb和acs，可使得β-欖香烯的發酵產量進一步提升。

12、更優選，在酵母基因組上再整合3個拷貝數的erg20和lsltc2基因，1個拷貝數的erg10、erg13、xfpk、pta、poxb和acs基因和2個拷貝數的idi1基因，從而獲得更佳的β-欖香烯的發酵產量。

13、本發明的重組酵母菌中，所述法尼基二磷酸合酶erg20的genbank登錄號為np_012368.1；所述萵苣來源的倍半萜合酶lsltc2的編碼基因的genbank登錄號為af489964.1；所述玫瑰來源的雙功能法尼基二磷酸合酶rrfps的編碼基因的genbank登錄號為kp768082.1；

14、所述idi1的genbank登錄號為np_015208.1；所述erg13的genbank登錄號為np_013580.1；所述的erg8的genbank登錄號為np_013947.1；所述erg10的genbank登錄號為np_015297.1；所述的erg12的genbank登錄號為np_013935.1；所述的mvd1的genbank登錄號為np_014441.1；thmgr的genbank登錄號為jx648390.1；

15、所述鯊烯合酶erg9的genbank登錄號為np_012060.1；所述xfpk的genbank登錄號為cbl90649.1；所述pta的genbank登錄號為qbj74152.1；所述poxb的genbank登錄號為np_418139.1；所述acs的編碼基因的genbank登錄號為at5g36880。

16、本發明還提供一種構建生產β-欖香烯的重組酵母的方法，包括使出發酵母菌株表達法尼基二磷酸合酶erg20、萵苣來源的倍半萜合酶lsltc2和玫瑰來源的雙功能法尼基二磷酸合酶rrfps，并在過氧化物酶體中表達idi1、erg13、erg8、erg10、erg12、mvd1和thmgr。

17、本發明的方法進一步包括使出發酵母菌株在細胞基質內包含以下變化中的一種或多種的步驟：

18、（1）鯊烯合酶erg9的表達量下調；

19、（2）過表達erg10和erg13；

20、（3）表達xfpk和pta；

21、（4）過表達idi1；

22、（5）表達poxb和acs。

23、本發明的方法具體包括：

24、（1）將法尼基二磷酸合酶erg20和萵苣來源的倍半萜合酶lsltc2的編碼基因進行融合，構建融合基因erg20~lcltc2；

25、（2）將2個拷貝數的所述融合基因erg20~lcltc2整合到出發酵母菌株的rdna位點中，獲得酵母菌株yb-1；

26、（3）將釀酒酵母內源的mva途徑關鍵基因idi1、erg13、erg8、erg10、erg12、mvd1、thmgr的c端分別插入epts1定位信號肽基因，并整合到酵母菌株yb-1染色體的ty3位點，獲得酵母菌株yb-2；

27、（4）將6個拷貝數的所述融合基因erg20~lcltc2整合至酵母菌株yb-2染色體的delta位點上，獲得酵母菌株yb-3；

28、（5）將6個拷貝數的玫瑰來源的雙功能法尼基二磷酸合酶rrfps的編碼基因整合到酵母菌株yb-3染色體的gal80位點上，獲得酵母菌株yb-4。

29、優選，本發明的方法還包括：（6）在所述酵母菌株yb-4的鯊烯合酶erg9的編碼基因n端插入泛素化標簽ubif，同時用hxt1啟動子替換erg9啟動子，獲得酵母菌株yb-5，所述泛素化標簽ubif的序列如seq?id?no.88所示。

30、更優選，本發明的方法還包括以下步驟中的一個或多個：

31、（7）在所述酵母菌株yb-5的x2位點整合3個拷貝數的所述融合基因erg20~lcltc2，得到酵母菌株yb-6；

32、（8）在所述酵母菌株yb-6的x3位點整合erg10、erg13基因，得到酵母菌株yb-7；

33、（9）在所述酵母菌株yb-7的lpp1位點整合xfpk、pta基因，得到酵母菌株yb-8；

34、（10）在所述酵母菌株yb-8的dpp1位點整合2個拷貝數的idi1基因，得到酵母菌株yb-9；

35、（11）在所述酵母菌株yb-9的rox1位點整合poxb、acs基因，得到酵母菌株yb-10。

36、本發明還提供上述重組酵母或上述方法構建的重組酵母在發酵生產β-欖香烯或構建生產β-欖香烯的微生物遺傳育種中的應用。

37、本發明還提供一種發酵生產β-欖香烯的方法，其包括培養上述重組酵母或上述方法構建的重組酵母的步驟。

38、本發明的有益效果至少在于：

39、本發明為β-欖香烯的發酵生產提供了一種新的重組酵母菌，其可高效生產β-欖香烯，為β-欖香烯的工業化生產提供了更有效的方法。