本發(fā)明涉及核酸或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)，尤其涉及一種用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在現(xiàn)代生物學(xué)研究與臨床診斷領(lǐng)域，核酸檢測(cè)技術(shù)始終占據(jù)著舉足輕重的地位。傳統(tǒng)的pcr技術(shù)能夠在體外快速擴(kuò)增特定的dna片段，然而其只能在反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，無(wú)法精確測(cè)定起始模板的拷貝數(shù)，并且在擴(kuò)增后開(kāi)蓋檢測(cè)的過(guò)程中，極易引發(fā)交叉污染，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。隨著科技的不斷進(jìn)步，為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)pcr?的不足，實(shí)時(shí)熒光定量?pcr?技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。它巧妙地將熒光信號(hào)與pcr擴(kuò)增相結(jié)合，在pcr反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，不僅能夠準(zhǔn)確地對(duì)起始模板進(jìn)行定量，還能有效避免擴(kuò)增后開(kāi)蓋檢測(cè)帶來(lái)的污染問(wèn)題，顯著提升了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性與重復(fù)性。

2、taqman探針?lè)ㄗ鳛閷?shí)時(shí)熒光定量pcr方法中的一種，其是在加入一對(duì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增的同時(shí)加入一個(gè)特異性熒光探針，探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；pcr?擴(kuò)增時(shí)，taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，熒光信號(hào)累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步，根據(jù)熒光信號(hào)與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系就可以得到實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，實(shí)現(xiàn)模板拷貝數(shù)的定量檢測(cè)。

3、taqman探針?lè)ㄗ畲蟮膬?yōu)勢(shì)在于其高通量和高敏感性，且無(wú)需在pcr后進(jìn)行電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。但是taqman探針的設(shè)計(jì)對(duì)序列有較高的要求，探針過(guò)短會(huì)造成探針tm過(guò)低而無(wú)法雜交到靶序列上，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致探針特異性降低；尤其對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多種病原體，引物之間的干擾會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)特異性降低，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)或區(qū)分多個(gè)型別；且使用taqman方法進(jìn)行多重pcr體系構(gòu)建時(shí)，通常會(huì)受限于儀器熒光通道數(shù)量；分管進(jìn)行構(gòu)建的話，也會(huì)增加試劑成本，操作也比較麻煩。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的組合物，可實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測(cè)。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的組合物，包括特異性正向引物、特異性反向引物和特異性探針，其中：

3、所述特異性正向引物和特異性反向引物用于擴(kuò)增靶dna；

4、所述特異性反向引物3’端起第i個(gè)核苷酸和第（i+1）個(gè)核苷酸之間添加阻斷基團(tuán)，4≤i≤8，且i為正整數(shù)；

5、所述特異性探針滿足如下條件：

6、1)所述特異性探針為單鏈核酸分子；

7、2)所述特異性探針的第一端的第1位核苷酸標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述特異性探針的第一端起第n個(gè)核苷酸標(biāo)記有第一淬滅基團(tuán)，所述特異性探針的第二端的第1位核苷酸標(biāo)記有第二淬滅基團(tuán)，9≤n≤30，n為正整數(shù)，且n小于所述特異性探針的核苷酸總數(shù)；

8、3)所述特異性探針的部分核苷酸序列與所述特異性反向引物3’端起第1個(gè)核苷酸至第i個(gè)核苷酸之間的核苷酸序列相同；

9、4)所述特異性探針不與所述特異性正向引物結(jié)合；

10、5)所述特異性探針不與所述特異性反向引物結(jié)合。

11、在本發(fā)明中，所述靶dna是指與靶核酸片段對(duì)應(yīng)的dna片段，靶核酸片段可以為dna或rna，靶核酸片段是指存在于待檢測(cè)病原體基因中特定區(qū)域的一段具有一定特異性的可以作為檢測(cè)目標(biāo)的核酸片段，該核酸片段可以與其他病原體或待檢測(cè)樣品自身基因序列有明顯區(qū)別。對(duì)于遺傳物質(zhì)為dna的病原體，所述靶核酸片段為靶dna；對(duì)于遺傳物質(zhì)為rna的病原體，所述靶核酸片段逆轉(zhuǎn)錄后得到所述靶dna。

12、在本發(fā)明中，所述病原體是指能夠引起宿主（如人類、動(dòng)物、植物等）疾病的生物或物質(zhì)，例如病毒、衣原體、立克次體、支原體、細(xì)菌、螺旋體和真菌等微生物和寄生蟲(chóng)等。在一種具體實(shí)施方式中，所述病原體為病毒。進(jìn)一步地，所述病毒的遺傳物質(zhì)可以為dna。

13、在本發(fā)明中，所述靶dna為雙鏈dna，所述特異性正向引物能夠與靶dna中的一條鏈特異結(jié)合，所述特異性反向引物能夠與靶dna中的另一條鏈特異結(jié)合，在dna聚合酶的作用下以雙鏈dna為模板進(jìn)行延伸反應(yīng)。所述特異性正向引物和特異性反向引物均為單鏈dna。

14、在本發(fā)明中，所述特異性正向引物和特異性反向引物的設(shè)計(jì)原則與本領(lǐng)域常規(guī)正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)原則相同或相似，區(qū)別在于，本發(fā)明在所述特異性反向引物3’端起第i個(gè)核苷酸和第（i+1）個(gè)核苷酸之間添加阻斷基團(tuán)，4≤i≤8，且i為正整數(shù)（i為4、5、6、7、8中的一個(gè)），同時(shí)i小于所述特異性反向引物的核苷酸總數(shù)；當(dāng)使用上述特異性正向引物和特異性反向引物對(duì)靶dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，特異性正向引物與靶dna的模板鏈結(jié)合并進(jìn)行延伸，遇到阻斷基團(tuán)后延伸停止，得到一條鏈長(zhǎng)度小于另一條鏈的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。

15、進(jìn)一步地，所述特異性反向引物的核苷酸總數(shù)可以為18-35個(gè)核苷酸。

16、在本發(fā)明中，所述特異性探針可以為單鏈dna分子。

17、在本發(fā)明中，所述第一端可以為特異性探針的5’末端，相應(yīng)的，所述第二端即為所述特異性探針的3’末端；所述第一端還可以為特異性探針的3’末端，相應(yīng)的，所述第二端即為所述特異性探針的5’末端。

18、在本發(fā)明中，n可以為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30中的任一種。

19、在本發(fā)明中，所述特異性探針的部分核苷酸序列與所述特異性反向引物3’端起第1個(gè)核苷酸至第i個(gè)核苷酸之間的核苷酸序列相同。進(jìn)一步地，所述特異性探針中與所述特異性反向引物相同的核苷酸序列應(yīng)當(dāng)靠近所述特異性探針的兩端，以便于和雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物中長(zhǎng)度較短的dna鏈結(jié)合，提高結(jié)合率。更進(jìn)一步地，所述特異性探針中與所述特異性反向引物相同的核苷酸序列靠近所述特異性探針的3’端，即位于所述特異性探針中被第一淬滅基團(tuán)和第二淬滅基團(tuán)修飾的核苷酸之間。

20、本發(fā)明中，上述結(jié)合是指特異性探針不會(huì)與特異性正向引物或特異性反向引物互為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，即在不添加靶dna或者待檢測(cè)樣品不含有相應(yīng)病原體的情況下，特異性探針保持卷曲狀態(tài)，標(biāo)記在所述特異性探針第一端的熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)會(huì)被第一淬滅基團(tuán)或/和第二淬滅基團(tuán)吸收，進(jìn)而無(wú)法檢測(cè)到相應(yīng)的熒光信號(hào)。當(dāng)pcr體系中存在至少兩種特異性正向引物和特異性反向引物時(shí)，特異性探針也不與靶向其他靶dna的特異性引物對(duì)結(jié)合。

21、本發(fā)明所涉及的原理如圖1所示，具體地：當(dāng)靶雙鏈dna存在的情況下，本發(fā)明提供的特異性正向引物和特異性反向引物與靶dna特異性結(jié)合并延伸產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物包括一條長(zhǎng)度較短的dna鏈和一條長(zhǎng)度較長(zhǎng)的dna鏈；同時(shí)，特異性探針可與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物中長(zhǎng)度較短的dna鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，并沿該dna鏈5’到3’的方向繼續(xù)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，隨著pcr擴(kuò)增的進(jìn)行，特異性探針結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（主要是熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間距離的改變），使得熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)無(wú)法被第一淬滅基團(tuán)和第二淬滅基團(tuán)吸收，熒光信號(hào)可被儀器檢測(cè)到。當(dāng)靶雙鏈dna不存在的情況下，特異性正向引物和特異性反向引物不與特異性探針互為模板鏈結(jié)合并延伸，特異性探針保持卷曲狀態(tài)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被第一淬滅基團(tuán)或第二淬滅基團(tuán)（主要是第一淬滅基團(tuán)）吸收，熒光信號(hào)無(wú)法被檢測(cè)。通過(guò)觀察是否有熒光信號(hào)，即可判斷是否有靶雙鏈dna的存在，確定待檢測(cè)樣品是否含有待檢測(cè)病原體，實(shí)現(xiàn)病原體的定性檢測(cè)。

22、當(dāng)需要對(duì)待檢測(cè)樣品中是否含有多種病原體進(jìn)行多重pcr檢測(cè)時(shí)，可通過(guò)改變特異性探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)對(duì)不同靶標(biāo)進(jìn)行區(qū)分；當(dāng)受限于熒光通道數(shù)量時(shí)，即在對(duì)特異性探針標(biāo)記相同的熒光基團(tuán)的情況下，通過(guò)改變各靶標(biāo)pcr產(chǎn)物的熔解溫度（tm值），在pcr擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)合特異性探針?biāo)鶖y帶的熒光基團(tuán)類型與各靶標(biāo)pcr產(chǎn)物的不同tm值，也可以實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測(cè)。

23、以hpv?18型為例對(duì)上述檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明：本發(fā)明提供的用于檢測(cè)hpv?18型的靶dna的核苷酸序列如seq?id?no:35所示；針對(duì)上述靶dna，本發(fā)明提供的特異性正向引物的核苷酸序列為5’-ggtgacactgtgcctcaatcct-3’（seq?id?no:21），特異性反向引物的核苷酸序列為5’-?acacacagctgccaggtgaag-3’（前16個(gè)核苷酸序列為seq?id?no:22），且在5’端起第16位核苷酸（g）與第17位核苷酸（t）之間連接阻斷基團(tuán)，特異性探針的核苷酸序列為5’-actgccagtccatcaacctatctgtgcaatggctgacatcccctaatgctgaagcaggc?-3’（seq?id?no:34），且5’端起第1位核苷酸（a）標(biāo)記有熒光基團(tuán)，第13位核苷酸（t）標(biāo)記有第一淬滅基團(tuán)，第59位核苷酸（c）上標(biāo)記有第二淬滅基團(tuán)。當(dāng)使用上述特異性正向引物和特異性反向引物對(duì)靶dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，得到的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物包括核苷酸序列為5’-ggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcctgcttca-3’（seq?id?no:49）的dna鏈，該dna鏈3’端起第1位核苷酸至第5位核苷酸（如上述序列中下劃線所示）與特異性探針5’端起第50位核苷酸至第54位核苷酸（如上述序列中下劃線所示）通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，由于特異性探針的3’端標(biāo)記有第二淬滅基團(tuán)，無(wú)法引發(fā)dna聚合酶的延伸反應(yīng)，因此，所述dna鏈充當(dāng)引物的作用，以特異性探針為模板進(jìn)行延伸發(fā)生二次pcr擴(kuò)增，第二次擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針形成雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)無(wú)法被淬滅基團(tuán)吸收，熒光信號(hào)被檢測(cè)，表明靶dna存在。

24、如上所述的組合物，所述特異性正向引物與特異性反向引物的摩爾比大于等于3：1，提高能夠與特異性探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物鏈。進(jìn)一步地，所述特異性正向引物與特異性反向引物的摩爾比為3：1-10：1，具體可以為3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、5：1、5.5：1、6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1、8.5：1、9：1、9.5：1、10：1或介于其中的任意兩者組成的范圍之內(nèi)。更進(jìn)一步地，所述特異性正向引物與特異性反向引物的摩爾比為10：1。

25、如上所述的組合物，所述特異性探針的長(zhǎng)度為20-60nt；gc含量在40%-60%。

26、如上所述的組合物，所述阻斷基團(tuán)為c3?spacer、c6?spacer、c9?spacer、c12spacer中的至少一種。

27、如上所述的組合物，所述熒光基團(tuán)選自fam（羧基熒光素）、joe（羧基二甲基熒光素）、tamra（四甲基羅丹明）、rox（羅丹明?x）、cy3、cy5、vic、hex（六氯熒光素）中的至少一種。

28、如上所述的組合物，所述淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2中的至少一種。

29、第二方面，本發(fā)明提供制備上述任一所述組合物的方法，包括：

30、s1、提供上述組合物中的特異性正向引物、特異性反向引物和特異性探針；

31、s2、將所述特異性正向引物、特異性反向引物和特異性探針組合得到所述組合物。

32、在本發(fā)明中，所述阻斷基團(tuán)、熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的修飾方法可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。

33、在本發(fā)明中，所述特異性正向引物、特異性反向引物和特異性探針可以單獨(dú)包裝，也可以混合在一起。

34、第三方面，本發(fā)明提供上述任一所述組合物的應(yīng)用，所述應(yīng)用為a1)-a4)中的至少一種：

35、a1)在實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析中的應(yīng)用；

36、a2)在制備實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析產(chǎn)品中的應(yīng)用；

37、a3)在檢測(cè)病原體中的應(yīng)用；

38、a4)在制備檢測(cè)病原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

39、第四方面，本發(fā)明提供一種基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr進(jìn)行病原體檢測(cè)的方法，包括：

40、d1、根據(jù)待檢測(cè)病原體的靶核酸片段，提供如上所述的組合物；制備待檢測(cè)樣品的核酸；

41、d2、利用所述組合物對(duì)所述核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，確定待檢測(cè)樣品是否含有所述待檢測(cè)病原體。

42、如上所述的方法，所述待檢測(cè)樣品的核酸可以為雙鏈dna。

43、如上所述的方法，本發(fā)明的方法適合任何病原體，如基因組是rna或dna的病原體。

44、如上所述的方法，所述方法的直接目的可為非疾病診斷和/或非疾病治療目的。上述應(yīng)用或方法為非疾病診斷的應(yīng)用或方法。上述應(yīng)用或方法不以獲得有生命的人體或動(dòng)物體的疾病診斷結(jié)果或健康狀況為直接目的。

45、如上所述的方法，所述方法為非疾病治療目的的應(yīng)用或方法。上述方法不以使有生命的人體或者動(dòng)物體恢復(fù)或獲得健康或減少痛苦為直接目的。

46、如上所述的方法，所述待檢測(cè)樣品可為來(lái)自非有生命的人體或動(dòng)物體的樣品，如環(huán)境樣品（如空氣）、衣物或毛巾或作為食品的動(dòng)物組織和/或器官等。

47、如上所述的方法，所述正向引物在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為90-1000nm，具體可以為90nm、100?nm、150?nm、200?nm、250?nm、300?nm、350?nm、400?nm、450?nm、500?nm、550?nm、600?nm、650?nm、700?nm、750?nm、800?nm、850?nm、900?nm、950?nm、1000?nm或介于其中的任意兩者組成的范圍之內(nèi)。

48、如上所述的方法，所述反向引物在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為30-100?nm，具體可以為30nm、35nm、40nm、45?nm、50?nm、55?nm、60?nm、65?nm、70?nm、75?nm、80?nm、85?nm、90?nm、95?nm、100?nm或介于其中的任意兩者組成的范圍之內(nèi)。

49、如上所述的方法，所述探針在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為100-1000?nm，具體可以為100?nm、150?nm、200?nm、250?nm、300?nm、350?nm、400?nm、450?nm、500?nm、550?nm、600?nm、650?nm、700?nm、750?nm、800?nm、850?nm、900?nm、950?nm、1000?nm或介于其中的任意兩者組成的范圍之內(nèi)。

50、如上所述的方法，d2中，可以通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)確定待檢測(cè)樣品是否含有待檢測(cè)病原體，例如，如果檢測(cè)到相應(yīng)的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待檢測(cè)樣品中含有待檢測(cè)病原體，如果未檢測(cè)到相應(yīng)的熒光信號(hào)，則說(shuō)明待檢測(cè)樣品中不含有待檢測(cè)病原體或者含有低于檢測(cè)限的病原體；此外，針對(duì)多重pcr檢測(cè)，也可以通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)和tm值確定待檢測(cè)樣品中是否含有待檢測(cè)病原體，例如，如果存在相同的熒光信號(hào)，通過(guò)熔解曲線分析tm值，進(jìn)而確定待檢測(cè)病原體的種類或分型，實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測(cè)。

51、可以理解的是，本發(fā)明提供的組合物適用于多種病原體檢測(cè)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容提供針對(duì)不同病原體的組合物并進(jìn)行多重pcr檢測(cè)。在一種具體實(shí)施方式中，待檢測(cè)的病原體的種類不低于兩種，可以為病原體的多種分型，也可以為多種不同類型的病原體。進(jìn)一步地，待檢測(cè)的病原體的種類不低于三種。更進(jìn)一步地，待檢測(cè)的病原體的種類不低于四種。

52、第五方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的組合物，包括用于檢測(cè)hpv?58型的第一組合物、用于檢測(cè)hpv?56型的第二組合物、用于檢測(cè)hpv?52型的第三組合物、用于檢測(cè)hpv?59型的第四組合物、用于檢測(cè)hpv?39型的第五組合物、用于檢測(cè)hpv?68型的第六組合物、用于檢測(cè)hpv?16型的第七組合物、用于檢測(cè)hpv?33型的第八組合物、用于檢測(cè)hpv?31型的第九組合物、用于檢測(cè)hpv?45型的第十組合物、用于檢測(cè)hpv?18型的第十一組合物、用于檢測(cè)hpv?66型的第十二組合物、用于檢測(cè)hpv?35型的第十三組合物和用于檢測(cè)hpv?51型的第十四組合物中的至少一種；

53、所述第一組合物包括用于檢測(cè)hpv?58型的第一正向引物、第一反向引物和第一探針；所述第二組合物包括用于檢測(cè)hpv?56型的第二正向引物、第二反向引物和第一探針；所述第三組合物包括用于檢測(cè)hpv?52型的第三正向引物、第三反向引物和第二探針；所述第四組合物包括用于檢測(cè)hpv?59型的第四正向引物、第四反向引物和第二探針；所述第五組合物包括用于檢測(cè)hpv?39型的第五正向引物、第五反向引物和第二探針；所述第六組合物包括用于檢測(cè)hpv?68型的第六正向引物、第六反向引物和第二探針；所述第七組合物包括用于檢測(cè)hpv?16型的第七正向引物、第七反向引物和第三探針；所述第八組合物包括用于檢測(cè)hpv?33型的第八正向引物、第八反向引物和第三探針；所述第九組合物包括用于檢測(cè)hpv?31型的第九正向引物、第九反向引物和第三探針；所述第十組合物包括用于檢測(cè)hpv45型的第十正向引物、第十反向引物和第三探針；所述第十一組合物包括用于檢測(cè)hpv?18型的第十一正向引物、第十一反向引物和第四探針；所述第十二組合物包括用于檢測(cè)hpv66型的第十二正向引物、第十二反向引物和第四探針；所述第十三組合物包括用于檢測(cè)hpv35型的第十三正向引物、第十三反向引物和第四探針；所述第十四組合物包括用于檢測(cè)hpv51型的第十四正向引物、第十四反向引物和第四探針；

54、所述第一正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:1所示的單鏈dna；

55、所述第二正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:3所示的單鏈dna；

56、所述第三正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:5所示的單鏈dna；

57、所述第四正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:7所示的單鏈dna；

58、所述第五正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:9所示的單鏈dna；

59、所述第六正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:11所示的單鏈dna；

60、所述第七正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:13所示的單鏈dna；

61、所述第八正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:15所示的單鏈dna；

62、所述第九正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:17所示的單鏈dna；

63、所述第十正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:19所示的單鏈dna；

64、所述第十一正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:21所示的單鏈dna；

65、所述第十二正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:23所示的單鏈dna；

66、所述第十三正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:25所示的單鏈dna；

67、所述第十四正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:27所示的單鏈dna；

68、所述反向引物的結(jié)構(gòu)通式如式1所示：

69、5’-n(a)-y-n(b)-3’?式1

70、式1中，n(a)、n(b)為核苷酸序列不同的多核苷酸片段，y為阻斷基團(tuán)；

71、所述第一反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:2,n(b)的核苷酸序列為ggacc；

72、所述第二反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:4,n(b)的核苷酸序列為tctac；

73、所述第三反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:6,n(b)的核苷酸序列為tttcc；

74、所述第四反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:8,n(b)的核苷酸序列為ggtag；

75、所述第五反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:10,n(b)的核苷酸序列為tccaa；

76、所述第六反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:12,n(b)的核苷酸序列為cccag；

77、所述第七反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:14,n(b)的核苷酸序列為ggatg；

78、所述第八反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:16,n(b)的核苷酸序列為atgcc；

79、所述第九反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:18,n(b)的核苷酸序列為catct；

80、所述第十反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:20,n(b)的核苷酸序列為gcatg；

81、所述第十一反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:22,n(b)的核苷酸序列為tgaag；

82、所述第十二反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:24,n(b)的核苷酸序列為tccc；

83、所述第十三反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:26,n(b)的核苷酸序列為caatg；

84、所述第十四反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:28,n(b)的核苷酸序列為caacc；

85、所述第一探針是核苷酸序列為seq?id?no:31的單鏈dna，且seq?id?no:31的第1位核苷酸標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)，第13位核苷酸標(biāo)記有第一淬滅基團(tuán)，第49位核苷酸標(biāo)記有第二淬滅基團(tuán)；

86、所述第二探針是核苷酸序列為seq?id?no:32的單鏈dna，且seq?id?no:32的第1位核苷酸標(biāo)記有第二熒光基團(tuán)，第12位核苷酸標(biāo)記有第三淬滅基團(tuán)，第57位核苷酸標(biāo)記有第四淬滅基團(tuán)；

87、所述第三探針是核苷酸序列為seq?id?no:33的單鏈dna，且seq?id?no:33的第1位核苷酸標(biāo)記有第三熒光基團(tuán)，第12位核苷酸標(biāo)記有第五淬滅基團(tuán)，第57位核苷酸標(biāo)記有第六淬滅基團(tuán)；

88、所述第四探針是核苷酸序列為seq?id?no:34的單鏈dna，且seq?id?no:34的第1位核苷酸標(biāo)記有第四熒光基團(tuán)，第13位核苷酸標(biāo)記有第七淬滅基團(tuán)，第59位核苷酸標(biāo)記有第八淬滅基團(tuán)。

89、如上所述的組合物，還包括用于檢測(cè)內(nèi)參基因的組合物。在一種具體實(shí)施方式中，所述內(nèi)參基因可以為人β-肌動(dòng)蛋白（beta-actin,?β-actin?）對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)dna。進(jìn)一步地，用于檢測(cè)人β-肌動(dòng)蛋白對(duì)應(yīng)靶標(biāo)dna的組合物包括第十五正向引物、第十五反向引物和所述第一探針；

90、所述第十五正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:29所示的單鏈dna；

91、所述第十五反向引物的結(jié)構(gòu)通式如式1所示，且n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:30,n(b)的核苷酸序列為tctcg。

92、如上所述的組合物，所述阻斷基團(tuán)為c3?spacer、c6?spacer、c9?spacer、c12spacer中的至少一種。

93、如上所述的組合物，所述第一熒光基團(tuán)、第二熒光基團(tuán)、第三熒光基團(tuán)、第四熒光基團(tuán)獨(dú)立地選自fam、joe、tamra、rox、cy3、cy5、vic、hex中的一種，且所述第一熒光基團(tuán)、第二熒光基團(tuán)、第三熒光基團(tuán)、第四熒光基團(tuán)中的任意兩個(gè)均不相同。

94、如上所述的組合物，所述第一淬滅基團(tuán)、第二淬滅基團(tuán)、第三淬滅基團(tuán)、第四淬滅基團(tuán)、第五淬滅基團(tuán)、第六淬滅基團(tuán)、第七淬滅基團(tuán)、第八淬滅基團(tuán)獨(dú)立地選自bhq1、bhq2中的一種。

95、第六方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的試劑盒，包括上述任一所述組合物。

96、第七方面，本發(fā)明提供一種基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr進(jìn)行人乳頭瘤病毒檢測(cè)的方法，包括：

97、制備待檢測(cè)樣品的核酸；

98、利用上述任一所述的組合物對(duì)所述核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，確定待檢測(cè)樣品是否含有人乳頭瘤病毒。

99、在本發(fā)明中，所述待檢測(cè)樣品可以為宮頸脫落細(xì)胞樣品或者環(huán)境樣品。

100、在本發(fā)明中，所述核酸可以為待檢測(cè)樣品的dna。

101、本發(fā)明提供一種新的用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr用的特異性正向引物、特異性反向引物和特異性探針，使用上述組合物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr過(guò)程中，通過(guò)特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)配對(duì)并繼續(xù)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使得特異性探針上的熒光信號(hào)發(fā)生變化，可被儀器檢測(cè)到。結(jié)合特異性探針?biāo)鶖y帶的熒光基團(tuán)類型與各靶標(biāo)的pcr產(chǎn)物的不同熔解溫度，實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測(cè)。