本發(fā)明涉及病毒檢測，特別是涉及一種同時檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的試劑盒。

背景技術：

1、羊繁殖障礙癥候群是影響?zhàn)B羊業(yè)經濟效益的重要問題，其病因復雜，常由多種病原體（如布魯氏菌、衣原體、弓形蟲、q熱立克次體等）或遺傳、環(huán)境因素共同作用引起。傳統檢測方法如病原分離培養(yǎng)、血清學檢測等存在耗時長、靈敏度低、單次檢測靶標有限等缺陷，難以滿足臨床快速診斷和精準防控的需求67。例如，培養(yǎng)法需數天至數周，且部分病原難以體外培養(yǎng)；血清學檢測易受交叉反應干擾，無法區(qū)分既往感染與現癥感染。

2、近年來，熒光定量pcr技術因其高靈敏度和特異性被逐步應用于動物疫病檢測。然而，常規(guī)單重pcr一次僅能檢測單一病原，導致檢測效率低下且成本高昂。盡管已有研究在豬、牛等動物中開發(fā)了多重熒光pcr技術（如同時檢測豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等病原的試劑盒），但這些技術多聚焦于單一畜種或特定疾病，缺乏針對羊繁殖障礙癥候群多病原同步檢測的系統性方案。

3、因此，開發(fā)一種針對羊繁殖障礙癥候群的多重熒光rt-pcr同步檢測技術，通過優(yōu)化引物探針設計、反應體系及擴增條件，實現多種病原體的快速、精準鑒別，對提升羊群健康管理水平、降低經濟損失具有重要意義，亦為后續(xù)分子流行病學研究及疫苗研發(fā)提供技術支撐。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的試劑盒，以解決上述現有技術存在的問題。

2、為實現上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明技術方案之一，一種同時檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的試劑盒，所述試劑盒包括如seq?id?no.1~seq?id?no.18所示的引物及探針。

4、本發(fā)明技術方案之二，一種非疾病診斷或治療目的的檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的方法，包括以下步驟：

5、（1）以提取的待測樣本核酸為模板，使用如seq?id?no.1~2、seq?id?no.4～5、seqid?no.7~8、seq?id?no.10~11和seq?id?no.13~14所示引物對待測樣本進行擴增，通過如seq?id?no.3、seq?id?no.6、seq?id?no.9、seq?id?no.12和seq?id?no.15所示探針對擴增產物進行識別；

6、如seq?id?no.3所示探針的5’端設置cy5.5熒光標記，3’端設置bhq2熒光標記；如seq?id?no.6所示探針的5’端設置fam熒光標記，3’端設置bhq1熒光標記；如seq?id?no.9所示探針的5’端設置rox熒光標記，3’端設置bhq2熒光標記；如seq?id?no.12所示探針的5’端設置cy5熒光標記，3’端設置bhq2熒光標記；如seq?id?no.15所示探針的5’端設置tamra熒光標記，3’端設置mgb熒光標記；

7、（2）同時設置ipc內標包括如seq?id?no.16~seq?id?no.18所示的引物及探針，如seq?id?no.18所示探針的5’端設置hex熒光標記，3’端設置bhq1熒光標記；進行熒光定量檢測，收集熒光通道的信號；同時，將濃度分別為1.0×105拷貝/μl的bdv、bru、tox、oea、caev、ipc內標重組質粒混合物作為陽性對照，將超純水作為陰性對照；

8、（3）結果判定：陰性對照應無ct值并且無特異性擴增曲線，陽性對照所有通道的ct值應≤30，且出現特異性擴增曲線，判定檢測結果成立；

9、如陰性對照和陽性對照結果不滿足以上條件，此次實驗視為無效；

10、在檢測結果成立的前提下，若樣品檢測結果ct值≤30，而且出現特異性擴增曲線，判定為陽性；若樣品30＜ct值＜37并出現特異性擴增曲線，判定為可疑，須對可疑樣品重新試驗，擴增后進行結果判定，結果為陽性者判定為陽性，結果為陰性者判定為陰性，如仍是可疑，可判定為陽性；若樣品ct值≥37時，超過本方法的檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現特異性擴增曲線，但本底較高的樣品，應判定為陰性。

11、同一份樣品判定：fam通道為陽性者判定為布魯氏菌病原體感染，rox通道為陽性者判定為弓形蟲病原體感染，cy5通道為陽性者判定為綿羊地方性流產病原體感染，tamra通道為陽性者判定為山羊關節(jié)炎病原體感染，cy5.5通道為陽性者判定為邊界病病原體感染；如果有多個通道出現陽性，則判為相應通道對應的多個病原體混合感染。

12、基于上述技術方案，本發(fā)明具有以下技術效果：

13、本發(fā)明經過對邊界病病毒（bdv）、布魯氏菌病（bru）、弓形蟲病（tox）、綿羊地方性流產（oea）、山羊關節(jié)炎病毒（caev）的單重體系測試后，建立了包含內標在內的六重體系，經過線性、最低檢測限、特異性、精密度和重復性、ntc重復、多重熒光rt-pcr和單一熒光rt-pcr的比較等指標的測試，目前開發(fā)的羊繁殖障礙癥候群rt-pcr多重熒光rt-pcr檢測試劑盒完全滿足開發(fā)需求，最低檢測限均可以達到10?copies/μl以下。

技術特征：

1.一種同時檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如seq?id?no.1~seq?id?no.18所示的引物及探針。

2.一種非疾病診斷或治療目的的檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.同一份樣品判定：fam通道為陽性者判定為布魯氏菌病原體感染，rox通道為陽性者判定為弓形蟲病原體感染，cy5通道為陽性者判定為綿羊地方性流產病原體感染，tamra通道為陽性者判定為山羊關節(jié)炎病原體感染，cy5.5通道為陽性者判定為邊界病病原體感染；如果有多個通道出現陽性，則判為相應通道對應的多個病原體混合感染。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述擴增反應的反應體系包括：coverallprobe?qrt-pcr?mix?ⅱ（5×）?5μl、引物mix?1μl、探針mix?1μl、樣品核酸模版?5μl、dd?h2o補至25μl。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述擴增反應的反應為：95?℃預變性20s，42?℃反轉錄30?min；95?℃變性10?s，60?℃退火延伸20?s，40個循環(huán)，每個循環(huán)結束時采集通道fam、hex、rox、tamra、cy5、cy5.5六個通道熒光信號。

技術總結
本發(fā)明公開了一種同時檢測邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產和山羊關節(jié)炎病毒的試劑盒，屬于病毒檢測技術領域。所述試劑盒包括如SEQ?ID?NO.1~SEQ?ID?NO.18所示的引物及探針。本發(fā)明經過對邊界病病毒、布魯氏菌病、弓形蟲病、綿羊地方性流產、山羊關節(jié)炎病毒的單重體系測試后，建立了包含內標在內的六重體系，經過線性、最低檢測限、特異性、精密度和重復性、NTC重復、多重熒光RT?PCR和單一熒光RT?PCR的比較等指標的測試，目前開發(fā)的羊繁殖障礙癥候群熒光RT?PCR多重檢測試劑盒完全滿足開發(fā)需求，最低檢測限均可以達到10?Copies/μL以下。

技術研發(fā)人員：史喜菊,白子龍,王素秋,吳丹,任彤,趙相鵬,杜思樂,張偉,高志強,鄧叢良,蒲靜,汪琳,劉全國,張小寒,徐立偉,安寧,周洪壘,趙云,何勝利
受保護的技術使用者：中國海關科學技術研究中心
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/4/28