三系雜交小麥種子純度分子標記及其引物對和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及育種技術領域，特別設及一種Ξ系雜交小麥種子純度分子標記及其引 物對和應用。
【背景技術】
[0002] 利用小麥雜種優(yōu)勢是提高小麥單產(chǎn)的有效途徑。目前，小麥利用雜種優(yōu)勢的主要 途徑有："Ξ系法"、"兩系法"和"化學殺雄法"。
[0003] Ξ系法是指將不育系、保持系和恢復系進行Ξ系配套，不育系為母本，保持系為父 本，相間種植，不育系所結(jié)種子下代仍為雄性不育，不育系循環(huán)繁殖或用W配制雜交種；W 不育系為母本，恢復系為父本，相間種植，通過恢復系授給不育系花粉，不育系植株上生產(chǎn) 的種子即為雜交種。
[0004] 兩系法主要是利用光溫敏雄性不育系和相應恢復系實現(xiàn)二系配套。光溫敏雄性不 育受隱性主基因控制，其育性的表達受外界溫光條件的影響。在敏感期，當環(huán)境溫度在不育 臨界溫度范圍時，表現(xiàn)為完全不育，運時不育系可用來與恢復系制種；當環(huán)境溫度在可育臨 界溫度范圍時，不育系又恢復正常可育，自交結(jié)實繁殖。在雜交制種中，將溫光敏不育系種 子和恢復系相間種植，來生產(chǎn)小麥雜交種。
[0005] 化學殺雄法是指將強優(yōu)勢組合的親本相間種植，在小麥抽穗一散粉關鍵時期，對 母本噴施化學藥劑，殺死母本的花粉，導致母本不育，通過父本授給母本花粉，使母本異交 結(jié)實，生產(chǎn)小麥雜交種。
[0006] 在上述Ξ種小麥雜交種生產(chǎn)過程中，雜交種的純度至關重要。因為種子的純度將 決定生產(chǎn)出的雜交種子能否在生產(chǎn)上應用，同時種子純度還影響雜交種的田間長勢長相和 雜種優(yōu)勢表現(xiàn)。Ξ系雜交小麥不育系親本種子繁殖或雜交種種子生產(chǎn)，采用不育系母本與 保持系父本或不育系母本與恢復系父本按不同行比種植。收獲時，父、母本必須分別收獲， 即先割除父本，后收獲不育系或雜交種，盡可能地降低種子的機械混雜。由于小麥是自花授 粉作物，父本保持系或恢復系可W自我繁殖，加上播種質(zhì)量、栽培措施、收獲環(huán)節(jié)復雜等影 響，在收獲過程中，會造成少量父本割除不及時或不完全，難免會有保持系或恢復系種子混 入，從種子形態(tài)上很難鑒別出混雜的種子，導致雜交種子的機械混雜，會降低雜交種的純 度。
[0007] 目前我國采用的小麥種子純度檢測方法分為組織化學鑒定法、幼苗鑒定法、田間 鑒定法和巧粒醇溶蛋白鑒定法(王立新等，2009)。但是運些方法都有一定的缺陷或局限性。 組織化學法是憑借苯酪和氨氧化鋼與種子各組織發(fā)生的顏色反應，根據(jù)種子間穎果和種皮 著色差異區(qū)別雜株的種子，而小麥品種之間種子組織對染料的反應差異不大，很難依此鑒 定種子純度。幼苗鑒定法是根據(jù)幼苗葉銷顏色辨別雜株，而幼苗葉銷顏色只有紫色和綠色， 如果雜株與測試品種幼苗葉銷顏色一致，則無法辨別雜株。田間鑒定法是根據(jù)國標《植物新 品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南普通小麥6(GB/T 19557.2-2004)》，對測試品種全生 育期25~56個重要表型和農(nóng)藝性狀進行一致性測試，需要一定面積的田間試驗，試驗周期 較長。運樣勢必費時費力，增加成本。又因有些農(nóng)藝性狀為數(shù)量性狀，株間差異往往為連續(xù) 數(shù)據(jù)，而且容易受環(huán)境因素影響，降低了測試結(jié)果的準確性。巧粒醇溶蛋白鑒種子定法是依 靠凝膠電泳技術展現(xiàn)品種間的醇溶蛋白亞基帶型的差異而判斷種子純度。但因醇溶蛋白的 所有組分在一塊凝膠中電泳分離，沒有足夠的空間展示所有組分，使該技術靈敏度大打折 扣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引有鑒于此，本發(fā)明實施例提供一種Ξ系雜交小麥種子純度分子標記及其引物對和 應用，主要目的是準確鑒定Ξ系雜交小麥種子純度。
[0009] 為達到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術方案：
[0010] -方面，本發(fā)明實施例提供了一種Ξ系雜交小麥種子純度分子標記，所述分子標 記為SSR分子標記，所述分子標記為位于2A染色體上的Wmc474或位于1B染色體上的Barc8。
[0011] 另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種Ξ系雜交小麥種子純度分子標記的引物對， 其中
[0012] 位于2A染色體上的Wmc474的引物對的序列如下：
[0013] Xwmc47 化：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
[0014] Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
[001引位于1B染色體上的Barc8的引物對的序列如下：
[0016] Xbarc化：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
[0017] XbarcSR:GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
[0018] 另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種Ξ系雜交小麥種子純度分子標記在AL型Ξ系 雜交小麥種子純度檢測中的應用。
[0019] 作為優(yōu)選，所述應用包括如下步驟：
[0020] 將Ξ系雜交小麥種子與非雜交種子按不同的設計比例混合形成多個試驗組，待發(fā) 苗后提取DNA;
[0021] 用所述SSR分子標記對應的引物對其幼苗DAN進行PCR擴增，聚丙締酷胺凝膠電泳 染色檢測，分別統(tǒng)計各試驗組的雜交種和非雜交種子的檢測數(shù)量；
[0022] 將統(tǒng)計出的檢測值與設計的理論值作相關性分析和回歸分析得到小麥雜交種純 度計算值與檢測值的方程；
[0023] 將待測Ξ系雜交小麥種子抽樣發(fā)苗、提取葉片DNA，然后利用所述SSR分子標記對 應的引物進行檢測，將檢測值代入上述方程，計算得到待測小麥雜交種純度。
[0024] 作為優(yōu)選，所述Ξ系雜交小麥種子分別與恢復系種子和保持系種子按不同的設計 比例混合形成多個試驗組。
[0025] 作為優(yōu)選，所述Ξ系雜交小麥種子與恢復系種子混合時，
[00%] W位于2A染色體上的Wmc474的引物對其幼苗DNA進行擴增，建立的混入恢復系種 子的小麥雜交種純度理論值與檢測值的方程如下:y = 4.rw+0.7875x，其中X為混入的恢復 系種子的檢測值，y為混入的恢復系種子的計算值；
[0027] W位于1B染色體上的Barc8的引物對其幼苗DNA進行擴增，建立的混入恢復系種子 的小麥雜交種純度理論值與檢測值的方程如下:y = -〇. 145化0.9314X，其中X為混入的恢復 系種子的檢測值，y為混入的恢復系種子的計算值；
[00%]所述Ξ系雜交小麥種與保持系混合時，
[0029] W位于2A染色體上的Wmc474的引物對其幼苗DNA進行擴增，建立的混入保持系種 子的小麥雜交種純度理論值與檢測值的方程如下:y = 〇. 2109+0.6797X，其中X為混入的保 持系種子的檢測值，y為混入的保持系種子的計算值；
[0030] W位于1B染色體上的Barc8的引物對其幼苗DNA進行擴增，建立的混入保持系種子 的小麥雜交種純度理論值與檢測值的方程如下:y = 〇. 4083+0.7583X，其中X為混入的保持 系種子的檢測值，y為混入的保持系種子的計算值。
[0031] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0032] 本發(fā)明根據(jù)AL型（普通小麥細胞質(zhì)雄性不育）雜種小麥品種與其不育系和恢復系 親本在DNA水平上的多樣性差異，利用小麥2A染色體上的分子標記Wmc474和1B染色體上的 分子標記barc8與育性恢復基因連鎖，對雜交種內(nèi)混雜不同比例的親本種子可W有效區(qū)分， 并在此基礎上建立了一種AL型雜交小麥種子純度分子標記檢測方法，該方法解決了需要田 間種植進行雜種純度鑒定費時費力的問題。確保小麥雜交種純度分子標記檢測的實用性， 必將對種子企業(yè)和農(nóng)民推廣小麥雜交種產(chǎn)生積極作用。
【附圖說明】
[0033]
[0034] 圖1至圖6為本發(fā)明實施例中Ξ系雜交小麥種子純度檢測圖。
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但不作為對本發(fā)明的限定。在 下述說明中，不同的"一實施例"或"實施例"指的不一定是同一實施例。此外，一或多個實施 例中的特定特征、結(jié)構、或特點可由任何合適形式組合。
[0036] 本發(fā)明實施例提供了一種Ξ系雜交小麥種子純度分子標記及其引物對，該分子標 記為SSR分子標記，本發(fā)明實施提供的分子標記為位于2A染色體上的Wmc474或位于1B染色 體上的Bar c8。
[0037] 上述分子標記的引物對具體如下，其中
[003引位于2A染色體上的Wmc474的引物對的序列為：
[0039] Xwmc47 化：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTCG，
[0040] Xwmc474R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA；
[0041 ] 位于1B染色體上的Barc8的引物對的序列為：
[004。 Xbar C化：GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGAA，
[0043] Xbarc8R:GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA。
[0044] 本發(fā)明實施例在上述分子標記的基礎上，提供了一種Ξ系雜交小麥種子純度分子 標記檢測方法，將上述的分子標記應用于AL型Ξ系雜交小麥種子純度檢測中。
[0045] 本發(fā)明實施例根據(jù)AL型(普通小麥細胞質(zhì)雄性不育）雜種小麥品種與其不育系和 恢復系親本在DNA水平上的多樣性差異，利用小麥2A染色體上的SSR分子標記Wmc474和1B染 色體上的分子標記barc8與育性恢復基因連鎖，對雜交種中混雜不同比例的非雜交種種子 進行有效區(qū)分。
[0046] 作為上述實施例優(yōu)選，本發(fā)明實施例的Ξ系雜交小麥種子純度分子標記在AL型Ξ 系雜交小麥種子純度檢測中的應用具體包括如下步驟：
[0047] 將Ξ系雜交小麥種子與非雜交種子按不同的設計比例混合形成多個試驗組，待發(fā) 苗后提取DNA;
[0048] 用上述的SSR分子標記對應的引物對其幼苗DNA進行PCR擴增，聚丙締酷胺凝膠電 泳染色檢測，分別統(tǒng)計各試驗組的雜交種子和非雜交種子的檢測數(shù)量；
[0049] 將統(tǒng)計出的檢測值與設計的理論值作相關性分析和回歸分析得到小麥雜交種純 度計算方程；
[0050] 將待測Ξ系雜交小麥種子抽樣發(fā)苗、提取葉片DNA，然后利用所述SSR分子標記對 應的引物進行檢測，將檢測值代入上述方程，最終得到待測小麥雜交種子純度。
[0051] 小麥雜交種是由母本和父本雜交獲得的，因此，在基因型上同時具有母本帶型和 父本帶型，屬雜合帶。通過PCR擴增和聚丙締酷胺凝膠電泳染色檢測后，雜交種在凝膠上顯 示雜合帶型，與父本、母本均可從凝膠帶型上區(qū)別開來。PCR擴增后，利用聚丙締酷胺凝膠電