專利名稱：滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的分子鑒定方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及水稻種子純度的分子鑒定方法，屬于農業生物技術領域，更具體地說屬于分子輔助育種領域。
背景技術：
種子是農業生產中最基本和最關鍵的生產資料，其純度的高低是衡量種子質量優劣的重要指標，我國對不同作物種子純度進行了嚴格的規定。我國是世界上最大的雜交水稻種子生產國和消費國，雜交水稻種植面積已占全國水稻種植總面積的60%以上，具有龐大的雜交水稻種子市場。雜交水稻種子的純度，直接關系到雜種優勢的發揮，純度的下降將導致作物產量的明顯降低，保證種子純度，是確保雜交水稻增產的重要措施，也是雜交水稻種業的命脈。種子純度降低的主要原因:一是由于制種過程的種子生產、收獲、脫粒、加工、運輸等程序中的非人為因素造成的生物混雜和機械混雜，二是一些繁種單位或個人為了片面追求經濟效益而忽視種子純度，甚至摻雜使假，人為因素導致種子純度降低。機械混雜指在良種繁育過程中的各環節中發生其它品種混雜。如:種、收、運、脫、曬、藏的過程中，造成繁育的品種內混有不同品種的種子；以及輪作的不合理和田間管理的不當，前作和雜草種子的自然脫落，以及使用了未經腐熟的廄肥和堆肥有可能混有作物種子和雜草種子等都會造成機械混雜。生物學混雜是指在良種繁育過程中，由于不同品種隔離不當，而使其發生了天然雜交造成品種純度、典型性狀以及產量和品質等降低，或是品種本身遺傳性發生變化和自然突變等導致品種的混雜。因此在水稻雜交種子銷售使用前，需對其純度和真實性進行鑒定。

種子鑒定技術經歷了由淺到深、由宏觀到微觀、由單一到多種技術相結合的過程。種子純度鑒定的主要方法有常規鑒定法、電泳鑒定法、分子生物學技術鑒定法。伴隨著現代農業技術的不斷發展，鑒定雜交水稻種子純度的方法由傳統的形態標記逐步發展到集形態標記、生化標記和DNA(Deoxyribonucleic Acid)分子標記鑒定為一體的綜合鑒定技術體系。DNA分子標記鑒定法與其它方法相比較，具有不受環境影響、多態性高、數量豐富、結果準確可靠等優點，主要應用的標記有RFLP(Restricted Fragment LengthPolymorphisms) > RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、SSR(Single SequenceRepeat)和 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)等，其中以 SSR 標記在水稻雜交種子鑒定中具有較強的利用優勢，它操作簡便、多態性高、重復性好、呈共顯性遺傳。利用SSR分子標記對水稻，玉米等雜交品種種子純度鑒定的研究已有不少報道。栽培稻全基因組DNA序列測定的完成以及比較基因組學的深入研究，為水稻的理論研究和遺傳育種提供了大量的生物信息。栽培稻全基因組DNA序列測定的完成以及比較基因組學的深入研究，為水稻的理論研究和遺傳育種提供了大量的生物信息。Shen等(2004)利用粳稻Nipponbare和秈稻9311基因組序列構建了水稻基因組水平的DNA多態性數據庫，其中包括了 I 703 176 個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)和 479 406個插入/缺失多態性(insert/deletion, InDel)。Nipponbare和9311序列間插入/缺失片段在25-75bp之間，易進行分子檢測。馮芳君等比較了水稻InDel和SSR標記多態性，認為InDel標記具有數量多、穩定性強及易于檢測的優點。盧寶榮等利用秈稻和粳稻特異InDel位點進行秈粳分化驗證，確定了與秈粳遺傳分化密切相關的34個InDel位點，構建了 “InDel分子指數法”進行秈粳性鑒定。在玉米、黃瓜上也有利用InDel標記準確鑒定雜交種子純度的報道。國家對雜交水稻DNA分子標記鑒定技術研究十分重視。2007年全國農技中心頒布GB/T20396-2006《三系雜交水稻及親本真實性和品種純度鑒定DNA分析方法》，同期頒布了 NY/T1433-2007《水稻品種鑒定DNA指紋方法》，為雜交水稻種子純度的分子檢測提供了依據。滇型雜交粳稻滇雜31 (榆密15AX南34)是云南農業大學稻作研究所用育性穩定的滇I型不育系榆密15A和優質抗病的恢復系南34配組育成的一個中熟三系雜交粳稻組合。該組合雜種優勢強、豐產性好、高抗稻瘟病、米質優、食味好、適應性廣，于2002年7月通過云南省農作物品種審定，目前在云南、四川、貴州、湖南、廣西等省區廣泛種植，獲得了顯著的經濟和生態效益。滇型雜交粳稻滇雜31種子不純主要是由機械混雜和生物學混雜引起的，混雜的類型主要有不育系、保持系、異品種、不育系育性回復的可育株等。國內外對雜交秈稻種子利用分子標記技術進行純度鑒定的研究較多，但在雜交粳稻種子純度鑒定的報道甚少，主要采用的是我們目前普遍使用的田間種植鑒定方法(將當年生產的雜交種子送往中國海南省，從幼苗至成熟期間根據植株形態特征和生育特性的差異，鑒別雜株的方法。鑒定的主要性狀有:株高、株型、莖粗和莖色、葉形和葉色、葉耳顏色和茸毛、穗形和穗色、芒的有無、芒的長短和顏色、粒形和粒色、抗病性和生長特性等)，該方法需要等到成熟期才能看到結果，所需時間周期長、工作量大，易受環境因素影響，成本高。目前還沒有一種分子純度鑒定技術能準確、快速、經濟的鑒定滇型雜交粳稻滇雜31種子純度。

發明內容
本發明目的是提供一種能準確、快速、高效地對滇型雜交粳稻滇雜31種子純度及雜株混雜類型進行分子鑒定的方法及其專用引物。本發明的技術方案是:1.滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的分子鑒定方法，包括以下步驟:(I)以滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子為對照材料，取對照材料和200粒以上的待鑒定水稻種子于20°C 35°C條件下發芽；(2)發芽后水培7 10天，分別取所述的對照材料的葉片為對照樣品和待鑒定水稻的葉片為待鑒定樣品，每個樣品分成4等份，4等份分別加入試劑1、試劑2、試劑3、試劑4后，按常規PCR反應程序進行PCR擴增；所述的試劑1、試劑2、試劑3和試劑4均是在相同的常規PCR反應體系分別加入不同的引物，試劑I為常規PCR反應體系加入DZ31-1引物，試劑2為常規PCR 反應體系加入DZ31-2引物，試劑3為常規PCR反應體系加入DZ31-3引物，試劑4為常規PCR反應體系加入DZ31-4引物；常規PCR反應體系是采用15 μ I反應體系，其中:ddH20 10.86 μ 1，擴增模板DNA為打取的樣品葉片，IOXPCR buffer 1.50 μ l,25mM MgCl2 1.14 μ 1,2.5mM dNTP mixture
1.20 μ 1，50 μ M 上游引物 0.10 μ 1，50 μ M 下游引物 0.10μ 1，5U.μ L-1Taq 0.10 μ I ；所述的常規PCR反應程序是預變性1:98 °C 2min,預變性2:96 V 2min ；變性940C 20s、退火 56°C 20s、延伸 72°C 30s, 35 個循環；延伸 72°C 7min ;10°C保存。(3)對PCR擴增產物用含EtBr 0.1 μ g/ml的2%瓊脂糖凝膠電泳分離；(4)在紫外透射儀上檢測PCR擴增產物及電泳結果，依據電泳結果，按如下①至④步的鑒別即鑒定出滇型雜交粳稻滇雜31種子中雜株數量:①用DZ31-1引物擴增后(圖1A)，滇型雜交粳稻滇雜31的雜交種分子量為442bp和521bp，基因型為雜合型(雙帶)，其它類型分子量的為雜株；②用DZ31-2引物擴增后(圖1B和圖2)，滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為346bp，其它類型分子量的為雜株；③用DZ31-3引物擴增后(圖1C)，滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為428bp，其它類型分子量的為雜株；④用DZ31-4引物擴增后(圖1D)，滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為350bp，其它類型分子量的為雜株；

所述的DZ31 -1引物由上游引物DA31 -1-F和下游引物DA31 -1-R組成，上游引物DA31-1-F的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，下游引物DA31-1-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示;所述的DZ31-2引物由上游引物DZ31-2-F和下游引物DZ31-2-R組成，上游引物DZ31-2-F的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，下游引物DZ31-2-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R組成，上游引物DZ31-3-F的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，下游引物DZ31-3-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述的DZ31-4引物由上游引物DZ31-4-F和下游引物DZ31-4-R組成，上游引物DZ31-4-F的堿基序列如序列表中SEQ IDNO:7所示，下游引物DZ31-4-R的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。2.一種滇型雜交粳稻滇雜31種子中雜株的混雜類型的分子鑒定方法:按照滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的分子鑒定方法中所述的方法進行，并在步驟(I)增加4個對照材料于20°C 35°C發芽，水培7 10天，所述的4個對照分別為母本保持系榆密15B種子、父本恢復系南34種子、母本育性回復株榆密15A可育株種子、秈稻種子；以及在步驟(4)按如下①至④步的鑒別及相互對比即鑒定出滇型雜交粳稻滇雜31種子中雜株的混雜類型:①DZ31-1引物用于鑒定保持系混雜(圖1A)，擴增后滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為442bp和521bp，基因型為雜合型(雙帶)，PCR產物分子量為442bp是母本保持系榆密15B混雜，PCR產物分子量為521bp是父本恢復系南34、或母本育性回復株榆密15A可育株、或秈稻混雜，；②DZ31-2引物用于鑒定除父母本以外的其它粳稻混雜(圖1B和圖2)，擴增后滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為346bp，PCR產物分子量為425bp是其它粳稻材料混雜；③DZ31-3引物用于鑒定秈稻或是秈粳雜交種子混雜(圖1C)，擴增后滇型雜交粳稻滇雜31雜交種分子量為428bp，PCR產物分子量為384bp為秈稻混雜，384bp和428bp均有的是秈粳雜交種混雜；
④DZ31-4引物用于在DZ31-1的基礎上鑒定雜株中的母本育性回復的可育株和恢復系混雜(圖1D)，擴增后350bp是父本恢復系南34混雜，PCR產物分子量為780bp是母本育性回復株榆密15A可育株混雜。本發明的有益效果:本發明提供的一組專用引物:DZ31-1引物，DZ31-2引物，DZ31-3引物和DZ31-4引物，鑒定滇型雜交粳稻滇雜31種子純度的準確性高，準確率為99%以上，而且鑒定一個雜交種群體用時不超過15天，鑒定材料只需發芽，PCR反應及電泳即可，達到了準確、快速、高效。本發明方法簡單易行，鑒定不受季節的限制，避免了田間形態鑒定的繁瑣程序，鑒別方法經濟，鑒定一粒種子是否為真雜種需人民幣約1.0 2.0元，鑒定成本低。本發明除了鑒定雜交種子純度外，還對混雜株的真實性進行了鑒定，確定雜株的混雜類型，能有效指導在生產過程中減少母本保持系、母本育性回復株、秈稻以及秈粳雜交種混雜發生，為制備高純度的雜交種子提供理論支持。


圖1是隨機抽取的人為混雜樣品種子純度的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖1中圖A、圖B、圖C、圖D中:M:Marker ;泳道1_5為對照材料；泳道1:母本保持系榆密15B ;泳道2:父本恢復系南34 ;泳道3:母本育 性回復株榆密15A可育株；泳道4:秈稻9311 ;泳道5:滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子；泳道6-14是隨機抽取的在滇型雜交粳稻滇雜31種子中人為混雜了母本保持系榆密15B種子、父本恢復系南34種子、母本育性回復株榆密15A可育株種子和秈粳雜交種種子的人為混雜樣品種子單株。圖A是用DZ31-1作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜；圖B是用DZ31-2作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜；圖C是用DZ31-3作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜；圖D是用DZ31-4作引物，瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜。圖2是用DZ31-2作引物，區分滇型雜交粳稻滇雜31親本材料與其它粳稻材料的瓊脂糖凝膠電泳圖。MiMarker ;泳道1:粳稻材料黎榆B ;泳道2:滇型雜交粳稻滇雜31母本榆密15B，泳道3:粳稻材料合系42B ;泳道4:滇型雜交粳稻滇雜31的父本南34 ;泳道5:粳稻材料C418 ;泳道6:粳稻材料安山稻。滇型雜交粳稻滇雜31母本和父本經DZ31-2作引物PCR擴增后分子量為346bp，其它粳稻材料黎榆B、合系42B、C418和安山稻PCR產物分子量為425bp，利用父母本材料與其它粳稻材料經PCR擴增后分子量的差異，因此用DZ31-2作引物可以用于滇型雜交粳稻滇雜31混雜類型中其它粳稻混雜鑒定。
具體實施例方式以下實施例采用人為混雜樣品用以證明本發明方法及其專用引物對滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子純度鑒定的準確性。用大田制種的滇型雜交粳稻滇雜31雜交種子為樣品，分別采用常規的田間形態鑒定方法和本發明方法鑒定種子純度，比較兩種方法鑒定結果，進一步考察本發明方法的快速、經濟和準確性。實施例1人為混雜樣品種子純度試驗(I)人為混雜種子的發芽:母本保持系榆密15B(Yumil5B)種子5粒，父本恢復系南34 (N34)種子5粒，母本育性回復株榆密15A可育株種子(Yumil5A_Rf) 5粒，秈粳雜交種種子5粒，以上材料人為混入套袋雜交制種的滇型雜交粳稻滇雜31種子80粒中，共計100粒種子作為待鑒定水稻材料即人為混雜樣品，人為混雜樣品中各種材料于20-35°C發芽。(2)5個對照材料的發芽:分別取母本保持系榆密15B(Yumil5B)種子5粒為對照1，父本恢復系南34(N34)種子5粒為對照2，母本育性回復株榆密15A可育株種子(Yumil5A-Rf)5粒為對照3，秈稻9311種子5粒為對照4，套袋雜交制種的滇型雜交粳稻滇雜31種子5粒為對照5，各種對照材料于20-35°C發芽。(3)發芽后水培7 10天采用一種葉片PCR快速取樣裝置(所述的一種葉片PCR快速取樣裝置的專利號為ZL200920111961.4，
公開日:2010.06.23，
發明者李東宣, 陳麗娟, 李娟 , 文建成, 董陳文華, 朱騫, 張小玲, 呂永剛, 黃大軍, 李成云, 朱有勇 申請人:云南農業大學