專利名稱：一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥學領域，具體地說涉及一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法及應用。
背景技術：
中藥注射液源自中醫藥經典驗方，對治療疾病起著重要的作用，并在臨床上廣泛應用，但是，中藥注射液導致的過敏反應卻制約了其進一步的發展。產生過敏反應的原因有中藥注射液成分復雜、質量不穩定、含有大分子物質如植物蛋白、鞣酸等以及大量半抗原成分。其中，大分子物質可以通過超濾以及分子篩等方法加以去除，但是中藥注射液中的小分子半抗原除了少數已知的，如小檗堿、茶堿、丹參酮等，還有很多未知的半抗原成分，目前還沒有一種確切的方法加以分離和鑒定。半抗原又叫做不完全抗原，在免疫學中指只有抗原性而無免疫原性的物質。半抗原分子量小，只有與體內的大分子物質如蛋白質等結合后才能形成完全抗原，常規分離抗原的方法難以分離半抗原。

發明內容
發明目的本發明的目的是提供一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法， 本發明的另一個目的是提供谷胱甘肽在分離中藥注射液中半抗原的應用。技術方案對于利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，本發明是利用谷胱甘肽分離中藥注射液中的半抗原，采用固定有谷胱甘肽S轉移酶(GST)的層析柱來分離獲得能與谷胱甘肽結合的半抗原成分。本發明利用半抗原的親電子基團易同蛋白質的親核基團反應這一特性，使半抗原與谷胱甘肽反應生成以共價鍵結合的復合物，再用能與谷胱甘肽特異性結合的GST將上述復合物從混合液中分離出來。值得注意的是，本發明所述谷胱甘肽包括但不限于谷胱甘肽，所述谷胱甘肽還包括含有谷胱甘肽的多肽以及谷胱甘肽類似物，所述谷胱甘肽能和谷胱甘肽S轉移酶發生酶-底物結合反應。另外，本發明所述的混合液是包含若干種已知或未知半抗原以及其他成分的混合液。本發明所述半抗原是可與谷胱甘肽形成共價復合物的半抗原。利用本發明所述方法分離混合液中的半抗原都屬于本發明的保護范圍。本發明主要包括如下步驟(I)制備固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱；(2)將混合液與還原型谷胱甘肽溶液充分混勻，反復通過步驟(I)制得的親和層析柱，用高濃度還原型谷胱甘肽溶液沖洗親和層析柱洗，洗脫結合到谷胱甘肽S轉移酶上的谷胱甘肽-半抗原復合物；(3)去除步驟(2)洗脫后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色譜法分離獲得谷胱甘肽-半抗原復合物的各個單一組分。
所述步驟⑴中固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱，其制備方法是PCR擴增 PGEX4T1質粒中的谷胱甘肽S轉移酶DNA序列，將其連接到pET28a(+)質粒中，轉化到感受態細菌，繼續培養并篩選出能正確表達谷胱甘肽S轉移酶的陽性克隆，繼續培養使細菌大量繁殖，收集細菌，用超聲破碎細菌，離心后取上清液通過鎳層析柱，將谷胱甘肽S轉移酶固定在層析柱上。所述谷胱甘肽S轉移酶是末端含有6個組氨酸的重組蛋白質。本發明是利用6個組氨酸能夠與鎳離子螯合的特性，將末端含有6個組氨酸的谷胱甘肽S轉移酶固定在層析柱上。添加組氨酸標簽對于重組蛋白質的分離與純化十分有利，細菌自身蛋白質不包含連續的6個組氨酸序列，而該序列可以同鎳離子形成牢固的螯合物，從而將重組表達的蛋白質固定在親和層析柱上，這種結合可以被高濃度的咪唑破壞，方便將重組表達的蛋白質解離下來，而達到分離和純化的目的。該方法步驟簡單，可獲得大量重組蛋白，并且純度高，雜蛋白少。有益效果本發明的一種利用谷胱甘肽分離中藥注射液中半抗原的方法可以迅速獲得大量潛在的半抗原，方法簡單易行，耗時短，可以有效節省時間和財力，還可為后續半抗原分析提供有力的技術支持。
具體實施例方式實施例II.制備固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱，利用重組谷胱甘肽S轉移酶的 His-Tag連接到鎳層析柱，制備成可以和谷胱甘肽進行特異性結合的GST親和層析柱，具體步驟如下(I)按照商業化試劑盒(B型質粒小量快速提取試劑盒，北京博大泰克)的方法收集pGEX4Tl質粒，用PCR方法擴增質粒中谷胱甘肽S轉移酶DNA序列；正向引物序列為GGAGGATCCGTATTCATGTCCCCTATACTAGGT，反向引物序列為GGACTCGAGAACCAGATCCGAITTTGGAGGATGGT。PCR 反應體系如下5· 0μ I 的 10XPCR 緩沖液，5. O μ I 25mMMgCl2,4. O μ I dNTP (IOmM)混合物，I. 0μ I pGEX4Tl質粒，2. O μ I正、反向引物混合物，37. 5 μ I ddH20和
O.5 μ ITaq酶(5單位/ μ I)。梯度PCR的反應條件為94°C，5分鐘；94°C 30秒，63°C 30秒， 720C 45秒循環4次；退火溫度每降低1°C再循環4次，94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 45秒，循環20次；72°C，10分鐘，4°C保溫。I %的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，收集堿基在750bp 左右的條帶，按照膠回收試劑盒(北京博大泰克)的方法回收PCR產物。用限制性內切酶 BamHI 和 Xho I 進行酶切反應，條件為7. 4 μ I ddH20,1.6μ I IOXK 緩沖液，1μ I BamH I， I μ I Xho I和5 μ I PCR膠回收產物，混合均勻后37°C反應2小時。(2)按照試劑盒的方法收集pET28a(+)質粒，用限制性內切酶BamH I和Xho I進行酶切，條件為7. 4μ I ddH20,1.6μ I IOXK 緩沖液，1μ I BamH Ι，1μ1 Xho I 和 5μ1 質粒，混合均勻后37°C反應2小時。(3)將步驟⑴和步驟⑵的酶切產物分別用I %的瓊脂糖凝膠電泳分離，收集目的條帶。膠回收產物進行連接反應，條件為酶切后的PCR產物和pET-28a(+)質粒片段各 5μ1，1.6μ1 Τ4連接酶緩沖液，3. 4μ I ddH20和Ιμ Τ4連接酶，混合均勻，4°C連接過夜。
(4)轉化質粒取上述連接產物8 μ I與100 μ I的Τ0Ρ10感受態細菌混合，置于冰水浴中30分鐘，然后放入42°C水浴中90秒，迅速取出置于冰上冷卻5分鐘，加入800 μ I LB 培養基(每升中含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，用IM NaOH調節pH 7. 0,121°C 滅菌15分鐘)，以200rpm的速度于37°C振搖45分鐘。10，OOOXg離心I分鐘，棄去上清， 細菌沉淀用200μ I LB培養基重懸，用接種棒將菌液均勻涂布在含有卡那霉素的固體LB培養基(每升中含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，用IM NaOH調節pH 7.0，15g瓊脂， 121°C滅菌15分鐘，在凝固前加入終濃度為30mg/l的卡那霉素，混合均勻后鋪在培養皿中) 上，37°C培養12-16小時。(5)轉化的細菌在有肉眼可見的菌斑出現時進行陽性克隆篩選。用接種針挑取單個克隆，接入到4ml含30mg/l卡那霉素的LB培養基中，37°C，200rpm振搖培養過夜。收集部分菌液進行PCR及酶切鑒定。合格的陽性克隆再進行DNA序列測定，選出能正確表達蛋白質的陽性克隆。(6)提取上一步中序列正確的陽性克隆的質粒，轉化到表達菌株BL21(DE3)的感受態細菌中。鋪瓊脂板后培養過夜，挑取陽性克隆接種于含有卡那霉素的LB培養基中繼續培養，部分用于保種，其余以200rpm的速度于37°C培養。當OD6tltl達到O. 6-0. 8左右時，加入 75nM的IPTG，繼續培養4小時。收集菌液，10，000 X g離心I分鐘，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細菌沉淀兩遍，PBS重懸細菌沉淀。用超聲儀在冰水浴中破碎細菌，10，OOOXg 離心10分鐘,收集上清。(7)將上清溶液恒速通過HiTrap Chelating純化柱。按照純化柱說明書用IOml 結合緩沖液洗滌純化柱，隨后分別用20，40，60，100,300,500mM的咪唑洗滌緩沖液梯度洗脫，收集蛋白質溶液。將蛋白質組分用G25分離、純化。測定濃度后分裝、凍干備用。(8)用適量的ddH20溶解谷胱甘肽S轉移酶，使溶液通過HiTrap Chelating純化柱，將其固定在柱上備用。2.用蛋白質過濾裝置過濾混合液，收集濾液，制成凍干粉，每克凍干粉用5 30mlddH20溶解后，加入還原型谷胱甘肽溶液，使其終濃度為100 μ Μ，混勻后于37°C恒溫水浴，反應30 60分鐘。反復通過固定了谷胱甘肽S轉移酶的純化柱。用PBS沖洗純化柱， 去除未與谷胱甘肽S轉移酶結合的組分。再用IOmM還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(由50mM Tris-HCl配制，pH 8.0)沖洗親和層析柱，洗脫結合到谷胱甘肽S轉移酶上的半抗原復合物。凍干，備用。3.上一步驟的洗脫液中含有谷胱甘肽-半抗原復合物及多余的谷胱甘肽，采用高效液相色譜法去除混合物中多余的谷胱甘肽，分離主要的谷胱甘肽-半抗原復合物。高效液相色譜分析條件流動相為甲醇-水-冰醋酸(41. 7-58-0. 3，v/v/v);流速為lml/min ； 檢測波長為29Inm;柱溫是35°C。通過高效液相的分離方法可以獲得多個谷胱甘肽-半抗原復合物純品，用于后續的質譜等鑒定。實施例2本發明還可用于中藥注射液中半抗原成分的分離，并可進一步用于半抗原的區分和鑒定。本實施例的混合液采用雙黃連注射液，其主要成分是金銀花、黃芩、連翹的提取物。制備固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱方法如實施例I所示，然后用蛋白質過濾裝置過濾雙黃連注射液，收集濾液，制成凍干粉，每克凍干粉用10 20ml ddH20溶解后，加入還原性谷胱甘肽溶液，使其終濃度為100 μ Μ，混勻后于37°C恒溫水浴，反應40 50 分鐘。反復通過固定了谷胱甘肽S轉移酶的純化柱。用PBS沖洗純化柱，去除未與谷胱甘肽S轉移酶結合的組分。再用IOmM還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(由50mM Tris-HCl配制， PH 8.0)沖洗親和層析柱，洗脫結合到谷胱甘肽S轉移酶上的半抗原復合物。凍干，備用。用高效液相色譜法去除洗脫液中多余的谷胱甘肽，分離主要的谷胱甘肽-半抗原復合物。高效液相色譜分析條件流動相為甲醇-水-冰醋酸(41. 7-58-0. 3，v/v/v);流速為lml/min ;檢測波長為291nm ;柱溫是35°C。通過高效液相的分離方法可以制備多個谷胱甘肽-半抗原復合物純品，用于后續的質譜等鑒定。試驗例I雙黃連注射液中的主要活性成分是金銀花、黃芩、連翹，目前已知該方劑中存在綠原酸，綠原酸起到抗菌消炎、保肝利膽的作用，同時也是具有致敏作用的半抗原。本試驗例通過小鼠體內淋巴細胞增殖實驗證明本發明所述方法可以有效分離雙黃連注射液中的致敏成分，包括綠原酸。按照實施例2的方法，將雙黃連注射液的凍干粉溶解于還原型谷胱甘肽溶液中， 連續通過固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱，將過柱前、后的溶液分別制成凍干粉。將上述注射液凍干粉溶解在DMSO中，配制成5%的溶液，綠原酸配制成O. 2%的 DMSO溶液，分別涂布于Balb/c小鼠的耳朵上，25 μ I/耳，連續涂布3天。以O. 05%二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)為陽性對照。在第6天將小鼠處死,分別取小鼠引流淋巴結，制備淋巴結細胞懸液，二氧化碳培養箱培養I小時，加入5mg/ml MTT，繼續培養4小時后，1，000 Xg離心5分鐘，棄上清，加入DMSO 100 μ I/孔，使紫色結晶溶解。用酶標儀在波長570nm測定吸光度(A)值。與溶劑對照組小鼠進行比較，計算刺激指數，刺激指數=A( ^^fe)/A(_WM)。刺激指數大于等于3的化合物有致敏性。統計結果如下表所示。表I.局部淋巴結試驗結果
受試物淋巴結重量 (mg)淋巴細胞計數 (106/ml)吸光度(A)值刺激指數空白對照6.3 ±1.95.2±1.10.49 士 0.05—DMSO6.7 士 1.85·5 士 1.20.55 士 0.07—0.2%綠原酸14.5 士 2.413.1 士 2.21.76 士 0.193.25%過柱前成分16.9 士 2.914.7 士 2.71.92 士 0.243.55%過柱后成分10.7 士 1.89.1 ±1.40.83 士 0.101.50.05% DNFB20.1 士 2.617.9 士 2.62.28 士 0.214.1由表I可見，DNFB這種已知的半抗原作為陽性對照可以刺激引流淋巴結中的淋巴細胞增殖，刺激指數達到4. I。通過將綠原酸與DMSO比較，綠原酸可引起淋巴細胞增殖，吸光度增加，刺激指數為3. 2，表明綠原酸具有致敏性。而比較通過重組谷胱甘肽S轉移酶層析柱前、后的雙黃連注射液的成分，發現過柱后的雙黃連注射液很少引起淋巴細胞增值，刺激指數小于3，注射液通過重組谷胱甘肽S轉移酶層析柱后可以顯著降低該注射液的致敏性，顯示大部分致敏物質被分離并去除。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱；(2)將混合液與還原型谷胱甘肽溶液充分混勻，反復通過步驟(I)制得的親和層析柱， 用高濃度還原型谷胱甘肽溶液沖洗親和層析柱洗，洗脫結合到谷胱甘肽S轉移酶上的谷胱甘肽-半抗原復合物；(3)去除步驟(2)洗脫后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色譜法分離獲得谷胱甘肽-半抗原復合物的各個單一組分。
2.根據權利要求I所述的一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，其特征在于所述谷胱甘肽S轉移酶是末端含有6個組氨酸的重組蛋白質。
3.根據權利要求2所述的一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，其特征在于，所述步驟(I)中固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱，其制備方法是PCR擴增 PGEX4T1質粒中的谷胱甘肽S轉移酶DNA序列，將其連接到pET28a ( + )質粒中，轉化到感受態細菌，繼續培養并篩選出能正確表達谷胱甘肽S轉移酶的陽性克隆，培養一定時間后破碎細胞，離心后取上清液通過鎳離子親和層析柱，將谷胱甘肽S轉移酶固定在層析柱上。
4.谷胱甘肽在分離中藥注射液中半抗原的應用。
全文摘要
本發明公開了一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法及應用，包括如下步驟制備固定有谷胱甘肽S轉移酶的親和層析柱，向混合液中加入還原型谷胱甘肽溶液，混勻后恒溫水浴，反復通過親和層析柱，再用高濃度谷胱甘肽溶液沖洗親和層析柱以洗脫結合到谷胱甘肽S轉移酶上的半抗原復合物；分離步驟洗脫液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色譜法獲得谷胱甘肽-半抗原復合物的各個單一組分。用本發明的方法可以迅速分離得到大量潛在的半抗原成分，方法簡單易行，耗時短，可以有效節省時間和財力，還可為后續半抗原分析提供有力的技術支持。
文檔編號B01D15/10GK102600639SQ201210003620
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者易宏偉 申請人:東南大學