本發明總體上涉及過程過濾系統，更具體地說，涉及一種利用在被濾過液側表面具有高空孔率和開孔率的中空纖維膜的細胞培養物的過濾方法。

背景技術：

1、過濾用于分離、澄清、改性和/或濃縮流體溶液、混合物或懸浮液。它通常是生物技術、制藥和醫療行業在藥物、診斷和化學品的生產、加工和分析階段的必要步驟。例如，過濾可用于從溶液中移除所需的化合物，或去除副產物，留下更濃縮的介質。這些過程可以通過選擇各種過濾材料、孔徑和/或其他過濾變量來適當修改。

2、當生產細胞培養物時，通常需要除去正在發育的培養物中的廢物。生物制造工藝的進步現在允許大規模生產細胞培養物，使得能夠生產重組蛋白、病毒樣顆粒(vlp)、基因治療顆粒和疫苗，通常使用處理容器裝置。去除代謝廢物并用額外的營養物更新培養物的細胞保留裝置廣泛可用。通常，這種保留使用切向流(tangential?flow)過濾，通過中空纖維膜處理容器培養物的灌流過濾來進行。此外，生物處理操作正在延長，連續培養已被采用。這樣的運行可能延長至數天、數周或數月。許多典型的部件，例如過濾器，期望在這樣長時間下不結垢，或不需要維護或更換的情況下充分運行。

3、中空纖維膜通常用于細胞培養物灌流和產物的分離，但這樣的使用可能因細胞碎片使膜結垢。并且，結垢可能導致預期的產品保留在膜中而不是使其穿過。中空纖維膜通常由聚醚砜(pes)、聚砜、纖維素、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯及其它材料制成，持續需要能夠抗結垢并同時允許過濾高固體含量的溶液的膜。

4、聚乙烯(pe)和聚偏二氟乙烯(pvdf)等氟樹脂是已普遍用于工業過濾的疏水材料，已知特定的分子不太可能吸附。具體地，發現多酚、多糖類和單寧的吸附水平低。另一方面，膜的結構因制造方法不同而有很大差異，即使使用相同的材料制造的膜，膜的結垢現象也因制造方法不同而有很大差異

5、以下專利文獻1描述了切向流過濾中透過液過濾速率與培養基流速之間的關系。還記載了含有致密層的多孔膜的使用。此外，如圖6所示，切向流過濾又稱橫流過濾，是一種待過濾溶液樣品沿相對于膜表面的平行方向回流，對膜產生一定的壓力，使小于膜孔徑的顆粒透過的方法。與此相反，常見的直接流動過濾方法，如注射器過濾器和離心過濾器，是將液體從頂部向下穿過膜表面，在這種情況下，樣品中所含的微粒會被截留在膜表面和內部，堆積起來造成堵塞，并對樣品造成過大的壓力負荷。與此相反，切向流過濾的特點是，因為樣品不斷沿相對于膜表面的平行方向回流，因此大于膜孔直徑的顆粒和分子停留在膜的上游，微粒在膜上的沉積受到抑制，對樣品的負荷較低。

6、以下專利文獻2記載了一種細胞培養方法和裝置，其能夠去除細胞生長抑制物質，使進行高密度培養時作為昂貴的高分子成分的血清中的至少一種成分返回培養槽，以降低運行成本。

7、以下專利文獻3描述了一種在表達重組蛋白的哺乳動物細胞培養物中提高重組蛋白產量的方法，包括在生物反應器中的無血清培養基中建立哺乳動物細胞培養物，并通過用l-天冬酰胺濃度為5mm或更低的無血清灌流培養基灌流誘導細胞生長停滯。

8、以下專利文獻4描述了一種在灌流培養過程中監控和測量來自過濾膜的透過液流量，以及當透過液流速至少為切向流過濾開始時透過液流速的10％時切換過濾膜的研究。

9、以下專利文獻5描述了一種在灌流培養中的切向流過程運行方法，該方法能高效地分離產物。

10、現有技術文獻

11、專利文獻

12、專利文獻1：日本特開2018-76291號公報

13、專利文獻2：日本特開2000-32977號公報

14、專利文獻3：日本特表2014-520534號公報

15、專利文獻4：日本特開2014-024824號公報

16、專利文獻5：國際公開第2015/188009號

技術實現思路

1、發明要解決的課題

2、專利文獻1-4中記載的是在產生有用物質的細胞的連續培養中，從培養液回收有用物質的方法，該方法包括從細胞的培養槽排出培養液，將與排出的培養液等量的新鮮培養基加入到上述培養槽中的滲出工序；以及使用實質上不具有致密層的多孔膜對從上述培養槽提取的培養液進行過濾的過濾工序，上述過濾工序中的過濾為切向流過濾。

3、此外，專利文獻5中，記載的僅僅是高效地分離產物和雜質的技術。

4、然而，雖然專利文獻1-4全部都公開了如過濾工序中透過液的速度等膜使用方面的研究，但沒有關于最適合切向流過濾的膜的記載，具體使用何種結構和材料能夠實現穩定的切向流也并不清楚。在連續過濾過程中，必然會發生膜的堵塞，必須加以解決，另外在分離方面也需要將細胞和微生物保留在濃縮側，而產物則不被膜阻止而透過到透過側這樣的基本的分離功能。此外，當培養對象是動物細胞時，由于如果剪切速率過高，會導致細胞生長出現缺陷，因此存在切向流的線速度不能提高的問題。

5、鑒于上述現有技術水平，本發明要解決的問題是提供一種更穩定的過濾方法，該方法能夠以較低的切向流線速度將培養物與生產物分離，且不會造成堵塞。

6、解決課題的方法

7、為了解決上述問題，本發明人反復進行了深入研究實驗，意外地發現，使用在被濾過液側表面具有高空孔率和開孔率的中空纖維膜，該膜對培養產物具有良好的滲透性，即使在切向流線速度較低的情況下也不容易堵塞，從而完成了本發明。

8、即，本發明如下所述。

9、[1]一種過濾方法，其包括使含有細胞、培養基、生成物及消泡劑的培養液通過多孔膜，從該培養液分離含有該生成物的濾液的過濾工序，其中從該多孔膜的被過濾液側表面的最外側表面(本文所述“最外側表面”對應的日文術語為“最表面”)到膜厚0.12％的厚度中的空孔率與該被過濾液側表面的開孔率之積為1800％·％及以上。

10、[2]根據前述[1]所述的過濾方法，其中從所述多孔膜的被過濾液側表面的最外側表面到膜厚0.12％的厚度中的空孔率為50％及以上。

11、[3]根據前述[1]或[2]所述的過濾方法，其中所述多孔膜的被過濾液側表面的開孔率為30％及以上。

12、[4]根據前述[1]～[3]中任一項所述的過濾方法，其中從被過濾液側表面的最外側表面到膜厚0.12％的厚度中的空孔率相對于該被過濾液側表面的開孔率的比例為1.70及以上。

13、[5]根據前述[1]～[4]中任一項所述的過濾方法，其中從該多孔膜的被過濾液側表面的最外側表面到膜厚0.12％的厚度中的空孔率與該被過濾液側表面的開孔率之積為2800％·％及以上。

14、[6]根據前述[1]～[5]中任一項所述的過濾方法，其中從所述多孔膜的過濾液側表面的最外側表面到在膜厚方向上300nm的厚度中的空孔率與該被過濾液側表面的開孔率之積為860％·％及以上。

15、[7]根據前述[6]所述的過濾方法，其中從所述多孔膜的過濾液側表面的最外側表面到在膜厚方向上300nm的厚度中的空孔率為35％及以上。

16、[8]根據前述[7]所述的過濾方法，其中所述多孔膜的過濾液側表面的開孔率為30％及以上。

17、[9]根據前述[1]～[8]中任一項所述的過濾方法，其中從所述多孔膜的被過濾液側表面的最外側表面到膜厚0.12％的厚度中的截面孔徑為1000nm及以下。

18、[10]根據前述[1]～[9]中任一項所述的過濾方法，其中從所述多孔膜的過濾液側最外側表面到在膜厚方向上300nm的厚度中的截面孔徑為300nm及以下。

19、[11]根據前述[1]～[10]中任一項所述的過濾方法，其中所述多孔膜的膜厚為100μm以上800μm以下。

20、[12]根據前述[1]～[11]中任一項所述的過濾方法，其中所述過濾工序的所述多孔膜的通量為1lmh以上。

21、[13]根據前述[1]～[12]中任一項所述的過濾方法，其中所述多孔膜為中空纖維膜，并且所述過濾工序為灌流培養過濾。

22、[14]根據前述[1]～[13]中任一項所述的過濾方法，其中所述灌流培養時所述中空纖維膜的切向流的膜內線速度為0.3m/s以下。

23、[15]根據前述[1]～[14]中任一項所述的過濾方法，其中形成所述多孔膜的樹脂為熱塑性樹脂。

24、[16]根據前述[15]所述的過濾方法，其中所述熱塑性樹脂含有氟樹脂作為主成分。

25、[17]根據前述[16]所述的過濾方法，其中所述氟樹脂包含選自偏氟乙烯樹脂(pvdf)、三氟氯乙烯樹脂、四氟乙烯樹脂、乙烯-四氟乙烯共聚物(etfe)、乙烯-單氯三氟乙烯共聚物(ectfe)、六氟丙烯樹脂、及這些樹脂的混合物中的至少一種。

26、[18]根據前述[15]所述的過濾方法，其中所述熱塑性樹脂含有聚烯烴樹脂作為主成分。

27、[19]根據前述[15]所述的過濾方法，其中所述熱塑性樹脂為聚乙烯(pe)或聚丙烯(pp)。

28、[20]根據前述[1]～[19]中任一項所述的過濾方法，其中所述生成物選自包括酶和抗體在內的蛋白質、氨基酸、核酸和有機物。

29、發明效果

30、本發明涉及的培養液的過濾方法由于使用了從作為多孔性過濾膜的被處理液側的膜的內側到作為濾液側的膜的外側的微孔的連通性良好(即，被濾過液側表面具有高空孔率和開孔率)的膜，因此能夠以更低的切向流線速度將包含細胞的培養物與包含酶、抗體的生產物分離，產物的透過性好，細胞不容易造成堵塞，過濾性能優異，此外，該方法是在過濾運行中膜不發生破損的過濾方法，因此能夠高效進行抗體等蛋白質的分離。