本專利申請屬于生物測定領域，具體涉及一種改進的用于單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體的分離純化的簡易裝置及濃度測定方法。

背景技術：

1、單克隆抗體藥物被廣泛用于自身免疫性疾病(如哮喘、風濕性關節炎、多發性硬化癥、紅斑狼瘡等)和腫瘤的治療。對于單克隆抗體藥物，除需關注產品的有效性外，還應重點關注安全性和分子的穩定性，特別是生產單克隆抗體過程中殘留的hcp、分子聚集等。因此，需要在單克隆抗體藥物研發、生產的各個環節對單克隆抗體進行純化和濃度測定。

2、現有技術中采用高效液相色譜儀結合protein?a親和層析柱進行單克隆抗體細胞發酵液上清的粗純化并定量檢測細胞發酵液上清中的單克隆抗體含量。該現有技術在使用的裝置方面存在以下缺點：

3、1.高效液相色譜儀及配套色譜柱價格昂貴；

4、2.儀器設備復雜，對操作人員實驗技能要求高；

5、3.高效液相色譜儀通量低，不適用于樣品制備。

6、而且，該現有技術在實驗操作層面還存在一個大問題——實驗操作不統一。即，對于每種單克隆抗體，需要配制各種不同的緩沖液、采用各種不同的親和層析柱、設置不同的檢測條件，甚至為了避免混亂安排不同組別的操作人員。這對于需要在同一時期并行研發、生產多個單克隆抗體藥物產品的cdmo企業而言，無疑導致了生產負擔明顯增加。

技術實現思路

1、鑒于現有技術中存在的上述技術問題，本技術的目的在于，提供一種可用于替代高效液相色譜儀進行細胞發酵液上清中單克隆抗體的分離純化的簡易裝置、及利用該簡易裝置進行單克隆抗體濃度測定的通用型方法。

2、本專利申請的技術方案包括：

3、本專利申請的技術方案包括：

4、1.一種用于單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體的分離純化的簡易裝置，其包括：

5、注射器；

6、親和層析介質，和

7、注射泵；

8、其中，所述注射器固定在注射泵上，注射器的出樣口與親和層析介質的進樣口連接，所述單克隆抗體細胞發酵液上清裝在所述注射器中時，所述注射泵可推動所述注射器的進樣桿，從而使所述單克隆抗體細胞發酵液上清以設定的流速從所述注射器進入所述親和層析介質，并經所述親和層析介質分離純化后從所述親和層析介質的出樣口流出。

9、所述注射器例如圖1所示，可以根據需要選擇常規的醫用注射器。

10、親和層析介質例如圖2所示，優選為protein?a親和層析介質，更優選為atprotein?a?diamond?plus親和層析柱。所述at?protein?a?diamond?plus親和層析柱可購買于博格隆博格隆(上海)生物技術有限公司，其是由耐堿protein?a同高剛性瓊脂糖基架通過環氧化學方式合成的親和介質，優點為其配基是基因工程重組的蛋白a片段，在上游構建的時候采用了耐堿的氨基酸替換了不耐堿的氨基酸，并且替換了蛋白酶敏感的氨基酸，使得該配基具有良好的堿穩定性，配基發酵及后續的純化過程均采用無任何動物源原材料。該介質可以用0.1～0.5m?naoh進行在位清洗，避免了使用昂貴且具有腐蝕性的在位清洗試劑，可有效節省成本，同時和at?protein?adiamond相比載量更高，在工藝放大過程可以選擇更小的柱體積來降低生產成本。

11、所述親和層析介質可以以預裝柱的形式提供。對于親和層析介質的數量不做任何的限制，可以根據實際需要進行調整，一般可以為1～30個，例如3～20個、或者5～10個。

12、所述注射泵例如圖3所示，可選擇常規的實驗室用注射泵，其可具有多個通道(例如1～20個通道、或者3～12個通道)，可同時卡裝同一規格或不同規格的多個注射器。所述注射泵可以為推拉式微量注射泵，一般可具有五個工作模式：灌注、抽取、先灌注后抽取、先抽取后灌注以及連續模式。所述注射泵例如可以為保定蘭格恒流泵有限公司生產的lsp10-1b型10通道注射泵。

13、本專利申請的簡易裝置可以適用于同時純化多個樣品，且每個樣品之間互不影響，這些樣品可以是同一單克隆抗體的樣品，也可以是不同單克隆抗體的樣品，它們的體積可以相同，也可以不同。使用該簡易裝置，操作簡便，無需對操作人員進行復雜的培訓；設備耗材成本低，不占用昂貴的高效液相色譜儀。但是，發明人也發現，使用該簡易裝置還存在兩個不足之處——一是對于不同單克隆抗體，尚缺少能夠通用的檢測條件；二是長期、多次使用后，對同一樣本的檢測結果會出現偏差。

14、針對上述第一個不足之處，發明人對使用該簡易裝置進行單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體濃度測定的檢測條件進行了探索研究，開發了對于各種igg1型單抗和igg4型單抗均適用的檢測條件，且檢測結果與高效液相色譜法的檢測結果基本一致，從而使得使用該簡易裝置進行的單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體濃度測定方法具有通用性，大幅減輕了cdmo企業的生產負擔。

15、因此，本專利申請的技術方案還包括：

16、2.一種單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體濃度的測定方法，其使用項1所述的簡易裝置進行，其包括如下步驟：

17、使用第一平衡緩沖液平衡親和層析介質，得到平衡好的親和層析介質；

18、將所述單克隆抗體細胞發酵液上清上樣至所述平衡好的親和層析介質；

19、使用第二平衡緩沖液對親和層析介質進行再平衡；

20、使用洗脫緩沖液對親和層析介質進行洗脫，收集含有目的單克隆抗體的洗脫液；

21、測定收集的洗脫液中所述單克隆抗體的濃度，并計算所述單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體的濃度：

22、向收集到的洗脫液中加入ph調節緩沖液使得洗脫液的ph為6.5～8.0，混勻，調節稀釋倍數進行稀釋，測定a280nm吸光值，

23、洗脫液中單克隆抗體的濃度＝a280nm吸光值÷單克隆抗體消光系數×稀釋倍數；

24、單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體的濃度＝洗脫液中單克隆抗體的濃度×洗脫緩沖液的體積÷單克隆抗體細胞發酵液上清的上樣體積；

25、所述第一平衡緩沖液為20mm的na2hpo4-nah2po4和150mm的nacl的水溶液，ph為6.8，所述第一平衡緩沖液的電導為18ms/cm；

26、所述第二平衡緩沖液為10mm的na2hpo4-nah2po4的水溶液，ph為7.2，所述第二平衡緩沖液的電導為1.3ms/cm；

27、所述洗脫緩沖液為15mm的枸櫞酸和7mm的na2hpo4的水溶液，ph為3.1，所述洗脫緩沖液的電導為1.3ms/cm。

28、3.根據項2所述的方法，其中，

29、所述單克隆抗體為igg1型單克隆抗體和/或igg4型單克隆抗體。

30、4.根據項2所述的方法，其中，

31、所述親和層析介質為at?protein?a?diamond?plus親和層析柱。

32、5.根據項2所述的方法，其中，

33、所述包含單克隆抗體的發酵上清液為真核細胞發酵上清液。

34、6.根據項2所述的方法，其中，

35、所述第一平衡緩沖液的體積為所述親和層析介質體積的3～6倍；

36、所述第二平衡緩沖液的體積為所述親和層析介質體積的3～6倍；和/或

37、所述洗脫緩沖液的體積為所述親和層析介質體積的3～6倍。

38、7.根據項2所述的方法，其中，所述單克隆抗體為選自下述a～j中的一種、或者任意兩種或三種或四種或五種或六種或七種或八種的組合、或者全部：

39、a.抗人白介素23單克隆抗體qx004n；

40、b.抗人白介素4受體α單克隆抗體qx005n；

41、c.抗人干擾素α受體1單克隆抗體qx006n；

42、d.人白介素-33單克隆抗體qx007n；

43、e.抗人tslp單克隆抗體qx008n；

44、f.抗人白介素17a單克隆抗體qx002n；

45、g.抗人cd117單克隆抗體qx013n；和

46、j.抗人il-12/il-23p40亞基全人源單克隆抗體qx001s。

47、8.根據項2所述的方法，其中，所述單克隆抗體為抗人白介素17a單克隆抗體，其包含三個重鏈互補決定區(cdr-h1、cdr-h2以及cdr-h3)和三個輕鏈互補決定區(cdr-l1、cdr-l2以及cdr-l3)，其中：

48、cdr-h1的氨基酸序列如seq?id?no：1syyvg所示；

49、cdr-h2的氨基酸序列如seq?id?no：2virigggtayaswakg所示；

50、cdr-h3的氨基酸序列如seq?id?no：3ssinggdi所示；

51、cdr-l1的氨基酸序列如seq?id?no：4qasqdirydls所示；

52、cdr-l2的氨基酸序列如seq?id?no：5aasklas所示；

53、cdr-l3的氨基酸序列如seq?id?no：6lgifsftdddgla所示。

54、9.根據項8所述的方法，其中，所述單克隆抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區；

55、其中，所述重鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no：7evqlvesggglvqpggslrlscaasgfslnsyyvgwvrqapgkglewv?gvirigggtayaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycsrssinggdiwgqgtlvtvss所示；

56、所述輕鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no：8aiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdirydlswyqqkpgkapklliya?asklasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclgifsftdddglafgggtkveik所示。

57、10.根據項8所述的方法，其中，所述單克隆抗體包含重鏈和輕鏈；其中，

58、所述重鏈的氨基酸序列如seq?id?no：9所示；

59、所述輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no：10所示。

60、11.根據項2所述的方法，其中，

61、ph調節緩沖液為2m的tris-hcl水溶液，ph為9.5。

62、12.根據項2所述的方法，其中，稀釋倍數為5～20。

63、針對上述第二個不足之處，發明人在長期的性能測試中發現，出現上述偏差的原因是，注射泵通常水平放置在桌面上，當設置流速較慢時，易出現液滴未能滴入水槽中，而產生樣品液掛壁現象，沿著裝置順流至注射泵體上，造成接觸面腐蝕嚴重，電氣設備損壞，嚴重影響設備性能及使用壽命，而且清潔時堿性樣品等還會對使用人員造成傷害。

64、針對上述技術問題，發明人設計了一種注射泵支架，其用于放置所述注射泵，使得所述注射泵離開水平面一定高度、且與水平面呈一定傾角放置，從而既能使樣品液順暢流出，又能有效防止樣品液掛壁。

65、即，本專利申請的技術方案還包括：

66、13.根據項1所述的簡易裝置，其還包括：

67、用于放置所述注射泵的注射泵支架；

68、所述注射泵支架具有可放置在水平桌面上的底面，以及位于所述底面的上方并與所述底面成一定傾角的頂斜面，所述頂斜面可放置所述注射泵；

69、所述頂斜面的下緣距離所述底面一定高度。

70、14.根據項13所述的簡易裝置，其中，所述傾角為45°～75°。

71、15.根據項13所述的簡易裝置，其中，所述頂斜面的下緣距離所述底面5～15cm。優選地，所述頂斜面的下緣距離所述底面20～50cm。

72、16.根據項13所述的簡易裝置，其中，所述頂斜面的下緣設置有阻擋部件，用于防止所述注射泵從所述頂斜面滑落。

73、17.根據項13所述的簡易裝置，其中，所述注射泵支架為不銹鋼材質。

74、有益效果

75、本技術開發了對于各種igg1型單抗和igg4型單抗均適用的檢測條件，且檢測結果與高效液相色譜法的檢測結果基本一致，從而使得使用該簡易裝置進行的單克隆抗體細胞發酵液上清中單克隆抗體濃度測定方法具有通用性，大幅減輕了cdmo企業的生產負擔。

76、本技術針對長期、多次使用后，對同一樣本的檢測結果會出現偏差這一不足，發明人在長期的性能測試中發現，出現上述偏差的原因是，注射泵通常水平放置在桌面上，當設置流速較慢時，易出現液滴未能滴入水槽中，而產生樣品液掛壁現象，沿著裝置順流至注射泵體上，造成接觸面腐蝕嚴重，電氣設備損壞，嚴重影響設備性能及使用壽命，而且清潔時堿性樣品等還會對使用人員造成傷害。

77、本技術發明人設計了一種注射泵支架，其用于放置所述注射泵，使得所述注射泵離開水平面一定高度、且與水平面呈一定傾角放置，從而既能使樣品液順暢流出，又能有效防止樣品液掛壁。