專(zhuān)利名稱(chēng)：一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法，特別是涉及一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)以來(lái)癌癥已經(jīng)成為人類(lèi)的頭號(hào)殺手，其中結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的早期診斷是取得良好治療效果的前提，近十幾年來(lái)，隨著各種先進(jìn)的圖像分析技術(shù)和高靈敏度的免疫學(xué)技術(shù)的使用，結(jié)直腸癌的診斷已取得了巨大的進(jìn)步。但仍有約35％的結(jié)直腸癌患者在獲得臨床診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生了擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移。目前尚缺乏可用于早期篩查結(jié)直腸癌的特異性腫瘤標(biāo)志物。
蛋白質(zhì)是細(xì)胞生命活動(dòng)的執(zhí)行者。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中必定伴隨有細(xì)胞蛋白質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量的改變，腫瘤細(xì)胞所合成和分泌的蛋白、多肽或其代謝產(chǎn)物可釋放入血，因此，從理論上說(shuō)，通過(guò)對(duì)血清蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)觀察有可能篩查出疾病早期的指標(biāo)和征兆。另一方面，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的千差萬(wàn)別也是由細(xì)胞蛋白質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量的差異所決定的，因此以血清蛋白質(zhì)的改變?yōu)橹笜?biāo)有助于腫瘤的早期篩查及生物學(xué)行為預(yù)測(cè)。
血清中含有大量功能未知的低分子量蛋白質(zhì)和多肽，其中包含有組織細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞所分泌的蛋白或多肽、或其代謝產(chǎn)物。由于這些低分子量蛋白質(zhì)分子量小、含量少，用以前的常規(guī)方法，如色譜、光譜、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳等很難檢測(cè)到。而蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀技術(shù)(SELDI-TOF-MS)以其高靈敏度和快速簡(jiǎn)便的全景式掃描為特點(diǎn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，使人們對(duì)復(fù)雜生物樣品中的大量蛋白做全景式的掃描搜索成為可能，對(duì)篩選和鑒定新的腫瘤特異性標(biāo)志物產(chǎn)生了革命性的影響。自2001年以來(lái)，應(yīng)用高靈敏的SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)血清樣本進(jìn)行全景式的掃描，尋找新的腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷和監(jiān)測(cè)治療效果，成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。以美國(guó)FDA和NIH的臨床蛋白質(zhì)組研究小組為代表的多家研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用此新技術(shù)分別對(duì)卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等體液樣本進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了多種新的腫瘤標(biāo)志物，其特異性和敏感性均優(yōu)于目前常用的檢測(cè)方法。
血清蛋白標(biāo)志物是有望從分子水平早期診斷結(jié)直腸癌，并正確判斷其生物學(xué)行為的途徑。目前所發(fā)現(xiàn)的以癌胚抗原(CEA)為代表的血清標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌的特異性和敏感性均較低，亟待探索新的結(jié)直腸癌標(biāo)志分子或分子譜。蛋白指紋圖譜分析是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展而開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)新技術(shù)，為腫瘤分子標(biāo)志物的篩選和鑒定開(kāi)辟了一條新思路。本發(fā)明即從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對(duì)結(jié)直腸癌血清蛋白進(jìn)行“全景”式的掃描、分析，以期建立有效的結(jié)直腸癌血清蛋白表型指紋圖譜，用于結(jié)直腸癌的臨床篩查，在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照者之間血清蛋白成分的差異，建立結(jié)直腸癌的血清蛋白指紋圖譜，探索新的結(jié)直腸癌血清蛋白標(biāo)志物，并且利用該血清蛋白指紋圖譜在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法，該方法包括下列步驟(a)制備血清樣品；(b)利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)檢測(cè)步驟(a)的血清樣品，獲得血清蛋白質(zhì)譜；(c)確定質(zhì)荷比8132.34Da±8.13Da的血清蛋白峰值是否存小于或等于10.059，和確定質(zhì)荷比4002Da±4.00Da的血清蛋白峰值是否小于或等于2.383；(d)確定該血清所獲自的患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明的一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法，其中所述的利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)檢測(cè)步驟(a)的血清樣品的條件是使用Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA提供的PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)，激光強(qiáng)度175，檢測(cè)靈敏度8。
本發(fā)明一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法可以用于早期篩查患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，具有較高的靈敏度，特異度和正確率。


附圖1A，2A，3A，4A和1B，2B，3B，4B是結(jié)直腸癌病人和健康人血清中相對(duì)含量存在顯著性差異的蛋白峰質(zhì)譜舉例，圖中橫座標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)，縱座標(biāo)為相對(duì)峰值(相對(duì)含量)，圖1A，2A，3A，4A是波譜圖樣(Spectra View)，圖1B，2B，3B，4B是膠樣圖(Gel View)，其中圖1A，1B；3A，3B分別顯示了m/z 8132和4070的標(biāo)志蛋白在結(jié)直腸癌病人中呈低表達(dá)，在圖1A，1B；3A，3B中上方的4例質(zhì)譜為非癌正常人血清質(zhì)譜圖片段。
圖2A和2B顯示m/z 4002蛋白在結(jié)直腸癌病人血清中呈低表達(dá)，其中上方4例質(zhì)譜是結(jié)直腸癌血清質(zhì)譜圖。
圖4A和4B顯示m/z 11092的蛋白在結(jié)直腸癌病人血清中呈高表達(dá)，其中上方4例質(zhì)譜是結(jié)直腸癌血清質(zhì)譜圖。
圖2是以m/z 8132和4002Da的血清標(biāo)志蛋白建立的區(qū)分結(jié)直腸癌和非癌健康對(duì)照者的分類(lèi)樹(shù)模型。質(zhì)荷比813234±8.13Da的蛋白峰的相對(duì)含量＞10.059的血清樣本被劃分入Terminal node3，理論上被判斷為正常人樣本，相對(duì)含量≤10.059的則被劃分入枝節(jié)點(diǎn)Node2內(nèi)，再根據(jù)m/z4002±4.00Da的蛋白峰的相對(duì)含量區(qū)分，相對(duì)含量≤2.383的樣本劃入Terminal nodel，理論上被判斷為結(jié)直腸癌病人樣本，相對(duì)含量＞2.383則劃入Terminal node2而被判斷為正常人樣本。M代表分子量，N為樣本例數(shù)。
圖3是患者王某某，病例號(hào)9542533，血清SELDI-TOF-MS質(zhì)譜圖。
圖4是患者吳某某，病例號(hào)9542543，血清SELDI-TOF-MS質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
一、建立本發(fā)明血清蛋白質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程(一)實(shí)驗(yàn)樣本
1、結(jié)直腸癌患者血清134例，男76例，女58例，平均年齡50歲，取自2002-2004年北京腫瘤醫(yī)院未經(jīng)手術(shù)及放化療、經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌的住院病人。臨床病理分期TNM I期15例，II期42例，III期48例，IV期29例。
2、對(duì)照血清87例，男52例，女35例，平均年齡47歲，取自健康志愿者。
(二)實(shí)驗(yàn)材料1、試劑及芯片尿素、乙腈、三氟乙酸，CHAPS購(gòu)自Sigma公司，Sinapinic acid(SPA)由Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA公司提供。
2、蛋白質(zhì)芯片金屬離子鏊合(immobilized metal affinity capture，IMAC3)蛋白質(zhì)芯片由Ciphergen Biosystems公司提供。其表面結(jié)合有金屬銅離子Cu2+，通過(guò)與被分析物中的蛋白質(zhì)和多肽分子發(fā)生鏊合作用而捕獲蛋白。
3、蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)(PBS II-C型，Ciphergen Biosystems，，Inc.Fremont，USA)是基于激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜的原理，檢測(cè)范圍從1000Da的小分子多肽到500kDa以下的大分子蛋白質(zhì)。
(三)實(shí)驗(yàn)步驟芯片處理1.樣品收集與預(yù)處理實(shí)驗(yàn)對(duì)象在取血前未接受任何藥物治療和放射治療等干預(yù)措施，結(jié)直腸癌患者和健康志愿者在取血前夜禁食水，次日晨空腹取外周靜脈血2ml，血樣采集后立即放入4℃冰箱靜置1小時(shí)，4℃1300r/min離心5分鐘，分離血清后，4℃4000r/min再次離心10分鐘，去除殘留的細(xì)胞或細(xì)胞碎片。在冰上將二次分離的血清轉(zhuǎn)移并分裝到新的離心管中，放入-80℃冰箱保存。使用前取出血清樣品，冰上融化后，取3ul血清加入6ul尿素緩沖液(9mol/L Urea，2％CHAPS，50mmol/LTris-Cl，pH9.0)變性，冰浴30分鐘，每隔5分鐘輕彈混勻一次。向9ul上述樣品中加入108ul結(jié)合緩沖液(250mM NaCl in PBS)，振蕩器上混勻。
2.芯片預(yù)處理、上樣和洗脫(1)將IMAC3芯片自包裝盒中取出，平放于操作臺(tái)上，向A-H加樣孔中每孔加入10ul 100mM CuSO4溶液，于濕盒中孵育10分鐘，甩干。重復(fù)此步驟一次。
(2)芯片放入盛有去離子水的試管中，用力振蕩若干次，取出后甩干。
(3)將IMAC3芯片固定于生物芯片處理器(Bioprocessor)內(nèi)。
(4)向生物芯片處理器A-H孔加入結(jié)合緩沖液(50mM醋酸鈉，pH4.0)，每孔加入200ul，400-600r/min振蕩5min，甩干，再次加入200ul，重復(fù)操作一次。
(5)上樣向每個(gè)加樣孔中加入100ul稀釋血清樣品，室溫振蕩孵育1小時(shí)。
(6)棄去未結(jié)合的樣品，每孔加入200ul結(jié)合緩沖液，振蕩5分鐘。棄去緩沖液，重復(fù)此次操作一次。
(7)甩干芯片，加入HPLC去離子水200ul，立即棄去，迅速甩干。
(8)將芯片從樣品處理器中取出，待芯片表面自然晾干后，每點(diǎn)各加新鮮配置的SPA(5mgSPA加入75ul乙腈，75ul 1％TFA，充分振蕩5分鐘以確保SPA充分溶解，然后離心1分鐘)，每次0.5ul，共加2次，兩次點(diǎn)樣之間需待芯片表面自然晾干后再次點(diǎn)樣。待晾干后，即可上機(jī)測(cè)定。
(四)芯片檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集和參數(shù)設(shè)置采用PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)讀取芯片信息。使用前先用加有ALL-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP-20芯片校正儀器，至0.1％范圍內(nèi)。芯片閱讀機(jī)參數(shù)設(shè)置如下激光強(qiáng)度175，檢測(cè)靈敏度8，優(yōu)化范圍2,000～10,000，最高分子量50,000。芯片上每個(gè)點(diǎn)采集130次。采用Ciphergen proteinchip3.0.2版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析結(jié)直腸癌患者和健康志愿者血清的蛋白質(zhì)譜差異并建立分類(lèi)樹(shù)模型。
(五)數(shù)據(jù)分析1、建立診斷模型隨機(jī)選取74例結(jié)直腸癌血清和48例對(duì)照血清用于建立結(jié)直腸癌診斷模型。建模的主要過(guò)程包括(1)血清蛋白質(zhì)譜儀掃描圖譜標(biāo)準(zhǔn)化。用總離子流校正所有圖譜，即假定建模所用的所有血清蛋白掃描圖譜的總離子流是相同的，根據(jù)此假設(shè)對(duì)每個(gè)圖譜的每個(gè)蛋白峰的峰值做相應(yīng)的調(diào)整，以減少不同芯片之間、儀器狀態(tài)波動(dòng)等因素引起的試驗(yàn)誤差。(2)用Biomarker Wizard軟件快速計(jì)算相同質(zhì)荷比(m/z)的蛋白在結(jié)直腸癌組和對(duì)照組之間峰值的差異，并計(jì)算P值。選擇信躁比(S/N)＞5和在所有圖譜中出現(xiàn)頻率＞30％的峰為有意義蛋白峰。然后采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)計(jì)算總樣本中結(jié)直腸癌組和對(duì)照組之間相同質(zhì)荷比的蛋白峰相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度差異的P值(以Excel表輸出差異蛋白的質(zhì)荷比和相對(duì)強(qiáng)度)，以P＜0.01時(shí)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)診斷模型的建立用Biomarker Pattern軟件對(duì)結(jié)直腸癌組和對(duì)照組間差異表達(dá)的蛋白峰做線形分類(lèi)分析，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)(包括Gini，Testing，Advance，Costs等)，選擇能將兩組盡可能完全分開(kāi)的蛋白峰或幾個(gè)蛋白峰的組合模型，確定為最佳分類(lèi)模型，即診斷模型。
2、診斷模型有效性的驗(yàn)證選定一分類(lèi)模型后，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，用所選擇的分類(lèi)模型盲法分析隨機(jī)選取的另外99例血清樣本(包括60例結(jié)直腸癌患者和39例健康對(duì)照者血清)的SELDI質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并根據(jù)盲法分析的結(jié)果計(jì)算該診斷模型能有效區(qū)分結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照者的靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)期值和陰性預(yù)期值，評(píng)價(jià)該模型的有效性。
1)靈敏度(sensitivity)指在患有結(jié)直腸癌的病人中出現(xiàn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的頻率，也就是真陽(yáng)性率。
2)特異性(specificity)指沒(méi)患結(jié)直腸癌的健康對(duì)照者中出現(xiàn)陰性檢測(cè)結(jié)果的頻率，也就是真陰性率。
3)陽(yáng)性預(yù)期值(positive predictive value，PPV)指在所有陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的人群中真正患有結(jié)直腸癌的病人的頻率。
4)陰性預(yù)期值(negative predictive value，NPV)指在所有陰性檢測(cè)結(jié)果的人群中真正沒(méi)患結(jié)直腸癌的人的頻率。
5)有效率(efficiency)或正確率(accuracy)有效率＝(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總測(cè)定例數(shù)*100％結(jié)直腸癌病人和非病人篩檢結(jié)果

根據(jù)上述評(píng)價(jià)篩查檢測(cè)方法有效性的指標(biāo)定義，各指標(biāo)可按下述公式進(jìn)行計(jì)算靈敏度＝TP/(TP+FN)×100％特異性＝TN/(TN+FP)×100％陽(yáng)性預(yù)期值＝TP/(FP+TP)×100％陰性預(yù)期值＝TN/(FN+TN)×100％有效率＝TP+TN/(TP+FP+FN+TN)×100％(六)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、建模組數(shù)據(jù)分析結(jié)果在用Biomarker Wizard軟件對(duì)74例結(jié)直腸癌患者和48例健康對(duì)照者血清的原始蛋白SELDI質(zhì)譜儀掃描圖譜標(biāo)準(zhǔn)化后，對(duì)兩組血清中蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比和相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，在分子量0～50,000范圍內(nèi)平均每個(gè)譜圖可測(cè)得216個(gè)有意義蛋白質(zhì)峰，結(jié)直腸癌組與對(duì)照組相比，有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰有78個(gè)(P＜0.01)。結(jié)直腸癌病人血清中有26個(gè)蛋白標(biāo)志分子表達(dá)下調(diào)，52個(gè)蛋白標(biāo)志分子表達(dá)上調(diào)(見(jiàn)圖1)。
2、分類(lèi)模型的建立采用Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA公司的Biomarker Pattern軟件對(duì)來(lái)源于Biomarker Wizard的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分別選取不同質(zhì)荷比的蛋白或蛋白組合用于建立分類(lèi)模型，并計(jì)算其正確劃分這122例樣本的正確率。最終確定由質(zhì)荷比8132.34Da±8.13Da和4002Da±4.00Da的兩個(gè)標(biāo)志蛋白的組合模式構(gòu)建的分類(lèi)樹(shù)模型具有最強(qiáng)的正確劃分能力。應(yīng)用此模型進(jìn)行分類(lèi)，此分類(lèi)樹(shù)具有2層，3個(gè)葉節(jié)點(diǎn)(圖2)。122例樣本在根節(jié)點(diǎn)(node 1)處被8132Da±8.13Da的標(biāo)志蛋白劃分成兩組，劃分界值為10.059，即峰值＞10.059的45例樣本劃分到右側(cè)的葉節(jié)點(diǎn)terminalnode 3內(nèi)，劃分為正常人；峰值≤10.059的77例樣本被劃分到左側(cè)枝節(jié)點(diǎn)node2內(nèi)。對(duì)劃分入Node2的77例樣本再根據(jù)4002Da±4.00Da的標(biāo)志蛋白的相對(duì)含量(峰值)進(jìn)行二次細(xì)分，劃分界值為2.383，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，這77例樣本中峰值≤2.383的70例樣本被劃分到的葉節(jié)點(diǎn)terminal node 1內(nèi)劃為結(jié)直腸癌，而峰值＞2.383的7例樣本被劃分到的葉節(jié)點(diǎn)terminal node2內(nèi)，判斷為正常人樣本。結(jié)合臨床病理資料分析，采用8132.34±8.13Da和4002Da±4.00Da兩個(gè)標(biāo)志蛋白的組合模式建立的結(jié)直腸癌診斷模型劃分上述樣本的結(jié)果見(jiàn)表1。
表1分類(lèi)模型對(duì)122例建模樣本的分析結(jié)果

3、診斷模型有效性的盲法驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，利用此分類(lèi)樹(shù)模型對(duì)隨機(jī)選取的99例樣本的SELDI蛋白表達(dá)譜進(jìn)行前瞻性盲法分析，以判斷所建立的診斷模型正確判斷結(jié)直腸癌病人和非癌正常人的靈敏度和特異性。結(jié)果60例結(jié)直腸癌樣本中57例劃分正確，3例劃分錯(cuò)誤，判斷正確率為95.000％；39例對(duì)照樣本中37例劃分正確，2例劃分錯(cuò)誤，判斷正確率為94.872％。該診斷模型對(duì)結(jié)直腸癌判斷的靈敏度為95.00％，特異性為94.872％，陽(yáng)性預(yù)期值為96.61％陰性預(yù)期值為92.50％，該診斷模型區(qū)分結(jié)直腸癌患者和非癌正常人的有效率為94.949％(表2)。
表2所建診斷模型對(duì)99例樣本的盲篩結(jié)果

靈敏度＝95.000％特異度＝94.872％陽(yáng)性預(yù)期值＝96.610％陰性預(yù)期值＝92.500％有效率＝94.949％二、本發(fā)明一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法實(shí)施例實(shí)施例1作為臨床結(jié)直腸癌可疑病例的輔助診斷方法患者王某某，男，51歲，病歷號(hào)9542533。患者因左下腹反復(fù)隱痛10年于2004年5月17日來(lái)北京腫瘤醫(yī)院就診，既往無(wú)結(jié)直腸炎等特殊病史及治療史。無(wú)大便性狀改變。鋇灌腸X線檢查發(fā)現(xiàn)直腸與乙狀結(jié)腸交界處有不規(guī)則充盈缺損，大小1.5×2.0cm，邊界清晰。行纖維結(jié)腸鏡檢查示直腸左前壁距肛門(mén)8cm絨毛狀腺瘤。病理組織活檢示絨毛狀腺瘤，上皮中重度不典型增生。常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物檢查CEA1.15ng/ml(參考范圍0-5ng/ml)，CA199 17.03u/ml(參考范圍0-27u/ml)，均無(wú)明顯異常。于2004年5月21日行血清蛋白SELDI質(zhì)譜儀檢查，結(jié)果顯示(圖3質(zhì)荷比4002Da的蛋白峰值為1.081，質(zhì)荷比8132Da蛋白峰值為6.254，根據(jù)所建診斷模型判斷此患者血清蛋白質(zhì)譜符合大腸癌患者表現(xiàn)。于2004年5月27日以直腸腫物性質(zhì)可疑行直腸前切除術(shù)。術(shù)后病理結(jié)果示直腸絨毛狀腺瘤早期癌變，局限于黏膜層，腸周淋巴結(jié)未見(jiàn)轉(zhuǎn)移。臨床病理分期為T(mén)1NOMO，I期，DukesA期。
實(shí)施例2患者吳某某，女，27歲，病歷號(hào)9542543。患者因間歇性腹痛、嘔吐半年，加重1個(gè)月，于2004年5月來(lái)北京腫瘤醫(yī)院就診。無(wú)大便性狀改變。腹部B超檢查發(fā)現(xiàn)右下腹回盲部高低混合回聲包塊大小7.0×5.0cm。行纖維結(jié)腸鏡檢查示回盲部巨大潰瘍型病變，邊緣呈環(huán)堤狀隆起，表面結(jié)節(jié)狀，底部污穢，腸腔不全梗阻。病理組織活檢示回盲部潰瘍性病變，所取組織為炎性肉芽組織。常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物檢查CEA 0.23ng/ml(參考范圍0-5ng/ml)，CA199 36.53u/ml(參考范圍0-27u/ml)，CA199輕度升高。入院后行血清蛋白SELDI質(zhì)譜儀檢查，結(jié)果顯示(圖4質(zhì)荷比4002Da的蛋白峰值為2.457，質(zhì)荷比8132Da蛋白峰值為7.817，根據(jù)所建診斷模型判斷此患者血清蛋白質(zhì)譜不符合大腸癌患者表現(xiàn)，根據(jù)質(zhì)譜圖判斷患者為大腸非癌性病變。于2004年5月9日以回盲部潰瘍性癌可疑，不完全腸梗阻行右半結(jié)腸切除術(shù)。術(shù)后病理結(jié)果示回盲部慢性潰瘍性結(jié)腸炎，腸周淋巴結(jié)反應(yīng)性增生。
上述病例顯示本可用于大腸癌可疑病例的輔助診斷，其對(duì)早期大腸癌檢出靈敏度和區(qū)分大腸良、惡性病變的準(zhǔn)確度高于常規(guī)血清腫瘤標(biāo)志物檢查，對(duì)于大腸癌病例的診斷與鑒別診斷具有較高的參考價(jià)值。
本實(shí)驗(yàn)所建立的一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法更重要的應(yīng)用價(jià)值在于可用于對(duì)特定人群，如大腸癌高發(fā)區(qū)或大腸息肉病等大腸癌高危人群進(jìn)行大規(guī)模的臨床篩查。其簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)使其可用于大規(guī)模的臨床病例篩查，這是迄今為止任何其它方法所無(wú)法達(dá)到的。
如本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用此方法對(duì)99例血清樣本進(jìn)行的大規(guī)模盲篩，每例患者僅需大約5μl血清，全部檢測(cè)分析1日即可完成，簡(jiǎn)便、快捷。總正確率達(dá)94.949％。這是其它方法所無(wú)可比擬的。
權(quán)利要求
1.一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法，該方法包括下列步驟(a)制備血清樣品；(b)利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)檢測(cè)步驟(a)的血清樣品，獲得血清蛋白質(zhì)譜；(c)確定質(zhì)荷比8132.34±8.13的血清蛋白峰值是否存小于或等于10.059，和確定質(zhì)荷比4002±4.00的血清蛋白峰值是否小于或等于2.383；(d)確定該血清所獲自的患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法，其中所述的利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)檢測(cè)步驟(a)的血清樣品的條件是使用Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA提供的PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)，激光強(qiáng)度175，檢測(cè)靈敏度8。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種在分離的血清中體外檢測(cè)結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的方法，該方法包括下列步驟(a)制備血清樣品；(b)利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI－TOF－MS)檢測(cè)步驟(a)的血清樣品，獲得血清蛋白質(zhì)譜；(c)確定質(zhì)荷比8132.34±8.13的血清蛋白峰值是否存小于或等于10.059，和確定質(zhì)荷比4002±4.00的血清蛋白峰值是否小于或等于2.383；(d)確定該血清所獲自的患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1892215SQ20051008078
公開(kāi)日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者顧晉, 劉興攀, 沈靖, 李振甫 申請(qǐng)人:北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院