專利名稱：用于檢測結直腸癌pik3ca基因熱點突變位點的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及一種用于檢測結直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點(E542K、E545K和H1047R)的試劑盒，能對結直腸癌PIK3CA基因突變位點進行檢測，特異性好，準確度高，可提高突變檢出率。
背景技術：
結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生存環境及生活方式的改變，CRC的發病率呈現逐年上升的趨勢，全球毎年新增病例約ー百萬，約五十萬患者因其死亡。人類惡性腫瘤的發生與多種因素有關，具有復雜的分子基礎，是多步驟、多基因改變的復雜過程。癌基因PIK3CA的發現為我們研究腫瘤的發生發展提供了新的方向，進ー步認識癌基因PIK3CA突變作用對于掲示結腸癌發生發展的分子機制具有重要的意義。PIK3CA是ー種體細胞突變癌基因，PIK3CA基因突變導致的PIK3CA過度表達可以導致PI3K的催化活性增強，促使細胞癌變，有致癌的功能。對PI3K家族全部成員的激酶結構域外顯子編碼區域進行序列分析顯示，PIK3CA是唯一一個可以發生體細胞突變引起致癌的基因，在結腸癌中突變率達32%。PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位雜交技術檢測到的，其定位于3q26. 3，長34kb，包含20個外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產生ー組長124kD的蛋白。PIK3CA編碼PI3Ks的pi 10催化亞單位，即PI3Kpll0a。近年來隨著結腸癌發病率的增高，深入研究結腸癌的發生發展機制，做到早預見、早發現、早診斷、早治療成為結腸癌防治的重點。大量數據表明PIK3CA中約90%突變發生在螺旋區(exon9)和激酶區(eXon20)這兩個熱點區域。這兩個突變熱點均能增強PI3K的脂質激酶活性，因此，檢測PIK3CA蛋白不僅可以做到結腸癌的早期診斷及判斷預后，對于結腸癌患者選擇合理的化療藥物提高化療效果亦具有重要的臨床意義。
目前，PIK3CA基因突變現有的檢測方法包括普通測序法、焦磷酸測序法以及熒光定量PCR法等。在實際應用中，用于檢測結直腸癌PIK3CA基因突變的方法主要為直接測序法，盡管該法為金標準，但是如果突變率低于15%，會發生漏檢的現象，且試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費時費力，因而一定程度上限制了該法的應用。焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是ー種新的序列分析技術,是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。在實際工作中，很多情況需要對已知序列的DNA片段進行序列驗證，而這種分析往往測幾十bp就可以滿足需要。在這種情況下，Sanger法未必是最合適的DNA序列分析技木。而焦磷酸測序技術是目前最適合這些應用的DNA序列分析技木。其特點是操作簡便、大通量、自動化，適合大量樣本的快速檢測，根據峰值對序列的突變位點進行判讀，從而實現PIK3CA基因突變位點的定點檢測
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供用ー種快速，準確，高通量的PIK3CA基因熱點突變(E542K、E545K和H1047R)檢測試劑盒。用于檢測結直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒，包括紅細胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無水こ醇、PCR擴增反應液、陽性對照品、陰性對照品以及焦磷酸測序反應液，其特征在于所述試劑盒包括檢測9外顯子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、測序引物9RCX ;檢測20外顯子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、測序引物20RCX，其序列為9F Biot i n-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG, 9R GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC,9RCX CCACAGAAAATCTTTCTCCT ；20F BiOt in-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT,20R TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC,20RCX :GTTGTCCAGCCACCA。進ー步地，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟(I)采集待測血液樣本，提取DNA ；(2)以該DNA為模板，用權利要求I所述用于擴增樣本DNA中PIK3CA基因的對應PCR引物9F、9R、20F、20R進行擴增，得到PCR反應產物；(3)對PCR反應產物用測序引物9RCX、20RCX進行焦磷酸測序，確定是否存在突變。優選地，步驟(2)的PCR反應按以下條件進行擴增94°C 5min ；98°C 30s,58°C 30s、68°C 30s, 35 個循環；最后 68°C 5min。本發明根據PIK3CA基因熱點突變位，分別設計了外顯子9和20PCR擴增引物以及焦磷酸測序引物。表I.外顯子9-20引物序列
權利要求
1.用于檢測結直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒，包括紅細胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無水乙醇、PCR擴增反應液、陽性對照品、陰性對照品以及焦磷酸測序反應液，其特征在于所述試劑盒包括檢測9外顯子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、測序引物9RCX ;檢測20外顯子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、測序引物20RCX，其序列為9F Biotin-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG，9R GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC,9RCX CCACAGAAAATCTTTCTCCT ；20F Biotin-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT，20R TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC,20RCX :GTTGTCCAGCCACCA。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟 (1)采集待測血液樣本，提取DNA； (2)以該DNA為模板，用權利要求I所述用于擴增樣本DNA中PIK3CA基因的對應PCR引物9F、9R、20F、20R進行擴增，得到PCR反應產物； (3)對PCR反應產物用測序引物9RCX、20RCX進行焦磷酸測序，確定是否存在突變。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟(2)的PCR反應按以下條件進行擴增94°C 5min ；98°C 30s、58°C 30s,68°C 30s，35 個循環；最后 68°C 5min。
全文摘要
本發明公開了用于檢測結直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒，包括紅細胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無水乙醇、PCR擴增反應液、陽性對照品、陰性對照品以及焦磷酸測序反應液，其特征在于所述試劑盒包括檢測9外顯子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、測序引物9RCX；檢測20外顯子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、測序引物20RCX。可檢測出與結直腸癌相關的PIK3CA基因熱點突變位點(E542K、E545K和H1047R)多態性，特異性好，準確度高。
文檔編號C12Q1/68GK102816839SQ20121023413
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者薛群, 王淑一, 徐建成, 鐘丹 申請人:杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司