專利名稱：：細胞外cAMP依賴的蛋白激酶-ECPKA的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
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，具體涉及細胞外cAMP依賴的蛋白激酶(ECPKA)作為細胞外癌癥檢測或治療監測的蛋白質標記的應用。背景枝術據統計，我國每年新增腫瘤患者160萬至170萬人，其中肺癌、肝癌、胃癌、食管癌和結直腸癌占新發病例的50%以上。《2005年中國衛生統計年鑒》顯示，2004年間我國醫院病人常見病醫療費用中，用于惡性腫瘤的治療費用達24.51億元，幾乎相當于腦血管病、缺血性心臟病和高血壓治療費用的總和(26.17億元)。癌癥給患者、家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。為了提高癌癥診斷和治療監控的水平，尋找癌癥生物標記物迫在眉睫。一些血清生物標記物，包括癌胚抗原(CEA)、血管內皮生長因子(VEGF)、異常DNA或RNA、神經元特異性烯醇酶(NSE)、癌癥抗原(如CA125)和細胞角蛋白片段(如CYFRA21-1)等，已經被用于評估癌癥診斷、預后、進展和治療效果。其中，最著名的是PSA(前列腺特異性抗原)。PSA是一種雄激素調節的絲氨酸蛋白酶，在正常和癌變的前列腺組織中均有表達。早在20世紀90年代，PSA就被列為前列腺癌生物標記。但是，這些分子中沒有一種對于癌癥病人和正常人樣本有良好的特異性或敏感性，其缺點主要是它們也在正常組織中表達，或者由于病人不同或日間差別而使這些分子的濃度變化多樣。cAMP依賴的蛋白激酶(PKA)涉及許多細胞過程，如細胞增殖、基因誘導、代謝、血管發生、離子通道調控和細胞凋亡。因此，PKA與多種癌癥的發生、發展及對冶療的應答密切相關。例如，福斯考林(forskolin)激活的PKA能直接激活雄激素受體，而不需要雄激素刺激。雄激素受體的異常激活導致前列腺腫瘤更加惡化和更難治療，且不再依賴雄激素。PKA由兩個不同的催化亞基(C)和兩個調節亞基(R)構成。已經證實，PKA存在3種催化亞基Ca、C卩和CY。調節亞基則有四種不同形式，分別為Rla、R陽、RIIa和RIIp。RII亞基在正常的、非增生組織中優先表達，并能抑制細胞生長；RI亞基則能刺激細胞生長，并參與癌癥進程。例如，RIamRNA高表達的卵巢癌病人通常臨床分期增高且預后更差，對順鉑(cisplatin)治療的反應降低。PKARIa在許多人類癌組織和細胞系中(包括乳腺癌、盲腸癌、肺癌和卵巢癌)存在過表達。另外，研究顯示Rla與細胞色素c氧化酶的vb亞基有相互作用，而后者涉及許多抗藥性的產生過程。由于在多種癌癥中存在過表達及其在癌癥發展中的重要角色，PKA己經被提議作為癌癥治療的新型分子靶標。但是由于該蛋白是一種胞內蛋白，因此作為標記物用于各種人類癌癥檢測時難度較大。
發明內容本申請的發明人通過研究發現，在正常人的血清中，檢測不到或僅含有極微量的細胞外cAMP依賴的蛋白激酶(即ECPKA),但是，在癌癥患者中，普遍存在ECPKA表達水平很高的情況。經常在腫瘤細胞中過表達的PKAI能促進ECPKA的分泌，乳腺癌、胰腺癌、食管癌、結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌等多種細胞均能分泌ECPKA，多種癌癥病人的血清ECPKA活性均比正常人有所升高。血清中的ECPKA能持續保持活性，但不能被額外加入的cAMP進一步激活，因此，可以將ECPKA作為蛋白質標記，通過檢測人體血清中的ECPKA的表達情況來進行癌癥的診斷，或者在癌癥治療的過程中通過監測ECPKA的活性來進行治療監測。因此，本發明的首要目的就在于提供一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA作為細胞外癌癥檢測的蛋白質標記的應用。本發明的另一個目的在于提供一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA作為細胞外癌癥治療監測的蛋白質標記的應用。在本發明的一個實施例中，分別測定了374例正常人血清樣品以及229例確診為癌癥患者的血清樣品中的ECPKA活性,結果顯示，癌癥病人血清中的ECPKA活性均值為10.98U/mL，是正常人血清ECPKA活性均值2.15U/mL的5.1倍。在癌癥病人血清中ECPKA活性升高，因此可用作檢測癌癥的蛋白質標記，這些癌癥包括胃癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、食道癌、肝癌和胰腺癌。在本發明的另一個實施例中，對乳腺癌、胰腺癌、食道癌、結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌七種癌癥患者的血清樣品使用統計分析軟件SPSS(社會科學統計軟件包，SPSSInc.公司產品)做Logistic回歸分析，用哈斯默-賴默斯(Hosmer-Lemeshow)適合度檢驗來測試模型的適合程度，結果顯示，對于患胰腺癌、食道癌、結腸癌、胃癌或肝癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于肺癌的病人，血清ECPKA為4U/mL的檢測點是最好的；對于乳腺癌的病人，血清ECPKA為2U/mL的檢測點是最好的。無論單獨使用還是聯合其他方法，ECPKA均可以在診斷和治療監測多種癌癥中起到重要作用。聯合其他標記物，或與成像技術如CT掃描聯用，能進一步提高ECPKA的效用。總之，ECPKA在檢測不同類型的癌癥中均有重要價值，且可以作為檢測和治療監測的一個重要標志物。圖1顯示了健康志愿者和癌癥病人中ECPKA的人群分布情況，其中A代表所有病人中ECPKA活性的頻率;B代表男性病人中ECPKA活性的頻率;C代表女性病人中ECPKA活性的頻率。圖2顯示了健康志愿者和癌癥病人中LDH的人群分布情況，其中A代表所有病人中LDH活性的頻率；B代表男性病人中LDH活性的頻率；C代表女性病人中LDH活性的頻率。正常的LDH水平在55和170U/L之間。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例1、1.1、正常人血清樣品ECPKA活性測定取正常人血清樣品共374例(血清樣品的具體信息見表1所示)，根據已報道的高敏放射性檢驗方法(PharmacTher1993;60:265-288.)開展ECPKA的放射性分析，具體方法如下使用的試劑盒為AUSAcAMP-DependentProteinKinaseAssayKit(Catalog#1132)，按說明書操作，樣品與cAMP結合后，再與y32P-ATP和生物素化的多肽(Kemptide)組成的特異性PKA底物反應。于30'C作用IO分鐘后，終止反應并進行超濾離心，未結合的Y32P-ATP可通過超濾膜。用液閃儀(LS6000TA，Beckman;Irvine,CA)測量純化后的32P-多肽產物，按說明書計算PKA活性。一個ECPKA活性單位定義為30°C，1分鐘內將1pmol32P從y32P-ATP轉移到回收蛋白上的酶量。線性范圍為0-250U/mL，日內和日間變化小于5%。測定結果如表l和圖l所示。表l、不同年齡和性別的正常人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取確診為胃癌患者的血清樣品共45例(血清樣品的具體信息見表2所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結果如表2所示。表2、胃癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.3、肺癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診肺癌患者的血清樣品共63例(血清樣品的具體信息見表3所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l),測定結果如表3所示。表3、肺癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1.4、乳腺癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診乳腺癌患者的血清樣品共30例(血清樣品的具體信息見表4所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結果如表4所示。表4、乳腺癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.44(2.07)1.5、結腸癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診結腸癌患者的血清樣品共29例(血清樣品的具體信息見表5所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結果如表5所示。表5、結腸癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.6、食道癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診食道癌患者的血清樣品共24例(血清樣品的具體信息見表6所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結果如表6所示。表6、食道癌病人樣本中ECPKA活性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.7、肝癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診肝癌患者的血清樣品共28例(血清樣品的具體信息見表7所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l),測定結果如表7所示。表7、肝癌病人樣本中ECPKA活性男性女性總數年齡樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)20-00000030-19.020019.0240-1319.11(4.54)10.191417.76(4.41)50-727.76(13.87)20.44(0.29)921.69(11.33)60-32.43(1.59)0032.43(1.59)70-11.590011.59總數2518.43(4.67)30.36(0.19)2816.49(4.29)1.8、胰腺癌患者血清樣品ECPKA活性測定取確診胰腺癌患者的血清樣品共10例(血清樣品的具體信息見表8所示)，用高敏放射性檢驗方法測定ECPKA活性(具體方法同l.l)，測定結果如表8所示。表8、胰腺癌病人樣本中ECPKA活性男性女性總數年齡樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)20-00000030-00000040-13.850013.8550-0012.1512.1560-412.88(7.01)24.62(0.12)610.12(4.76)70-0020.20(0.20)20.20(0.20)總數511.07(5.72)52.36(0.99)106.71(3.10)將表2到表8的各種癌癥患者的血清樣品ECPKA活性數據匯總，結果如表9所示;同時以表9的數據作圖，得到圖l所示的ECPKA人群分布情況圖。表9、不同年齡和性別的癌病人樣本中ECPKA活性年齡男性女性總數樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)20-120.6511.48211.06(9.59)30-98.57(5.20)87.08(2.19)177.87(2.86)40-3217.10(3.47)1710.18(2.89)4914.70(2.50)50-3713.08(3.84)199.32(3.24)5611.80(2.75)60-4111.12(1.99)156.16(1.85)569.79(1.56)70-328.36(235)179.50(3.05)498.76(1.85)總數15212.20(1.40)778.60(0.74)22910.98(1.05)由表1—表9和圖1A的結果可見，雖然個體間ECPKA的活性水平有所差異，但在癌癥病人血清中ECPKA水平顯著高于正常人群，與健康對照相比，各種癌癥病人的血清ECPKA活性一致升高。癌癥病人血清中的ECPKA活性均值為10.98U/mL，是正常人2.15U/mL的5.1倍。另外從圖1B和圖1C可以看出，男性和女性血清樣本中，ECPKA無顯著性差異，說明性別不是影響血清ECPKA水平的因素。實施例2、作為質量控制手段，乳酸脫氫酶(LDH)的活性水平與溶血、樣品制備以及保存有關，本實施例對實施例1中所使用的血清樣品的LDH的活性水平進行了定量。2.1、取實施例1的正常人血清樣品(共374例)，用LactateDehydrogenase(LD-L)kit測定LDH的活性水平，具體測定方法如下用LactateDehydrogenase(LD-L)kit(procedure#228-uv)(SigmaDiagnosticsInc.;St.Louis，MO)試劑盒，檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性。按說明書操作，在準備好LDH試劑后，加入樣品，30'C放置30秒，30秒后立即記錄340nm處的吸光值。為了確定1分鐘內的吸光值變化，3(TC放置60秒后，再次讀取340nrn的吸光值。按說明書計算LDB活性，日內和日間變化小于5%。測定結果如表10所示。表10、不同年齡和性別的正常人樣本中LDH活性年齡男性女性總數樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)20-4077.23(4.76)4380.43(4.40)8378.91(3.22)30-4174.44(4.16)4277.89(5.28)8376.18(3.36)40-4181.68(4.49)297637(5.76)7079.48(3.54)50-3978.86(4.96)3483.70(3.68)7381.12(3.15)60-2077.65(5.72)1284.96(4.45)3280.39(3.95)70-2184.24(6.61)1099.59(14.23)3390.44(6.20)V-必/r總數20278.65(2.02)17281.55(2.29)37479.99(1.52)2.2、取實施例1的癌癥患者的血清樣品(共229例)，用LactateDehydrogenase(LD-L)kit測定LDH的活性水平(具體方法同2.1)，測定結果如表ll。表11、不同年齡和性別的癌癥病人樣本中LDH的活性年齡男性女性總數樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)樣本數平均值(SE)20-1158.67157.392108.03(50.64)30-9103.53(16.17)883.13(9.99)1793.93(9.81)40-32100.38(7.68)1785.49(10.25)4995.22(6.17)50-3785.50(9.40)1978.54(10.77)5683.13(7.16)60-4188.09(6.22)1596.89(11.58)5690.44(5.48)70-3283.08(8.46)1784.30(15.05)4983.50(7.51)總數15290.40(3.90)7785.12(3.10)22988.61(3.13)根據表10和11的結果作圖，得到圖2所示的LDH人群分布情況圖。由圖2A、表10和表11結果可見，LDH活性在正常人和癌癥病人中不存在顯著的差異。使用統計分析軟件SPSS13.0(社會科學統計軟件包，SPSSInc.公司產品)做Logistic回歸分析顯示，低LDH活性的樣本中ECPKA的分布與正常LDH水平的樣本中ECPKA的分布相近，說明樣本的制備和保存過程未影響LDH水平。另外從圖2B和圖2C可以看出LDH在男性和女性中的水平有微小區別，但無統計學差異。實施例3、ECPKA作為生物標記物的統計學分析為了確定ECPKA作為細胞外癌癥檢測的蛋白質標記的最佳數值范圍，用不同的ECPKA活性水平確定其表達對癌癥發生的預測值，本實施例對實施例1的癌癥患者的血清樣品(共229例)進行分析，選取的檢測點分別為l、2、4、8禾niOU/mL，用靈敏度、特異性、陽性預測值PPV值和陰性預測值NPV值來計算每個檢測點的ECPKA水平，測定結果如表13所示。首先對靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV值)和陰性預測值(NPV值)做出如下解釋靈敏度是檢測出確定癌癥樣本的陽性概率；特異性是檢測出確定未患癌癥樣本的陰性試驗的概率；陽性預測值PPV值是給定陽性試驗中癌癥實際存在概率；陰性預測值NPV值是給定陰性試驗中無癌癥的概率。表12、評價一個實驗真實性的資料歸納表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以表12中所舉數據為例，靈敏度、特異性、PPV值和NPV值的計算公式如下:靈敏度za/(a+c)X100%特異度-d/(b+d)X100%陽性預測值(PPV)=a/(a+b)X100%陰性預測值(NPV)=d/(c+d)X100%表13、不同ECPKA檢測點的敏感度、特異性、陽性預測值和陰性預測值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表13的結果顯示，以統計學分析結果作為確定檢測點的依據，在一定的可信區間內，兼顧特異性和敏感性，當選擇ECPKA活性值10U/mL作為檢測點時，對陽性和陰性的預測值比低濃度更準確。對靈敏度、特異性、PPV值和NPV值分析發現，28U/mL的檢測點能預測各種癌癥。如果選取8U/mL做為檢測點，對各種癌癥的檢測靈敏度為37%，特異性為95%，陽性預測值PPV為81%,陰性預測值NPV為71%。實施例4、ECPKA作為生物標記物的Logistic回歸分析本實施例對實施例1所述乳腺癌、胰腺癌、食道癌、結腸癌、肺癌、胃癌和肝癌七種癌癥患者的血清樣品使用統計分析軟件SPSS13.0(社會科學統計軟件包，SPSSInc.公司產品)做Logistic回歸分析，用哈斯默-賴默斯(Hosmer-Lemeshow)適合度檢驗來測試模型的適合程度，結果見表14A和14B所示。表14A、所有樣本的Logistic回歸分析s*PKA指示物優勢比95%可信區間#值22<25.83.9~8.7<0扁124<47.24.7~11.0<0細128<89.35.216.6<0扁1*回歸模型中其他變量性別、年齡#對于優勢比的可信區間表14B、特定癌癥和對照樣本的Logistic回歸分析*iiX~~指示物優勢比95%可信區間#值3.1~15.9〈0.00013.5~14.7O細l4.9~25.3<0扁13.3~13<0.00014.1~14.3<0細13.4~15.4O扁l2.0~12.10.00041.6~8.80,00210.58.60.32891.811.2O細l3.0~16.3O.00014.6~31.5〈0.00011.4~9.30.00661.5~8.70.00433.2~23.7<0扁12.0~12.10.00054.4~27.5O.000110.567.9<0.00013.60.9~14.40.07403.71.0~13.70.04894.10.8~22.20.0999*:Logistic回歸模型中其他變量性別、年齡。由于特異性腫瘤的樣本數很小，在Logistic回歸中使用連續的"年齡"，而非前面表格中使用的"年齡組"。#:對于優勢比的可信區間。(樣本數=45)22<224<428<87.07.211.1肺癌(樣本數=63)22<224<428<86.57.77.3乳腺癌(樣本數=30)22<224<4》8<85.03.82.0結腸癌(樣本數=29)22<224<428<84.57.012.0食道癌(樣本數=24)22<224<428<83.63.68.7肝癌(樣本數=28)2228<2<4<84.911.126.7胰腺癌(樣本數-io)2228<2<4<8根據表14B的結果，選取具備最佳"優勢比"和"95%可信區間"時所對應的PKA活性值，作為最佳活性檢測點，具體結果如下-對于患胃癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患肺癌的病人，血清ECPKA為4U/mL的檢測點是最好的；對于患乳腺癌的病人，血清ECPKA為2U/mL的檢測點是最好的；對于患結腸癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患食道癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患肝癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的；對于患胰腺癌的病人，血清ECPKA為8U/mL的檢測點是最好的。綜上所述，癌癥病人血清中的ECPKA活性均值遠高于正常人血清ECPKA活性均值，與多種癌癥的發生發展有著密切的相關性，因此血清中的ECPKA可作為各種細胞外癌癥檢測或治療監測的蛋白質標記，具有十分廣闊的應用前景。權利要求1、一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA的應用，其特征在于，用作細胞外癌癥檢測的蛋白質標記。2、如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述細胞外癌癥檢測是檢測血清中ECPKA的活性是否過高。3、如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測采用高敏放射性檢驗方法。4、如權利要求13中任一項所述的應用，其特征在于，所述癌癥包括胃癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、食道癌、肝癌和胰腺癌。5、如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述胰腺癌、食道癌、結腸癌、胃癌或肝癌的血清ECPKA活性檢測點為8U/mL;肺癌的血清ECPKA活性檢測點為4U/mL;乳腺癌的血清ECPKA活性檢測點為2U/mL。6、一種細胞外cAMP依賴的蛋白激酶ECPKA的應用，其特征在于，用作細胞外癌癥治療監測的蛋白質標記。7、如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述治療監測是監測血清中ECPKA的活性水平。8、如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述監測采用高敏放射性檢驗方法。9、如權利要求68所述的應用，其特征在于，所述癌癥包括胃癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、食道癌、肝癌和胰腺癌。全文摘要本發明涉及一種利用細胞外cAMP依賴的蛋白激酶(ECPKA)作為人類細胞外癌癥檢測或治療監測的標記物的應用。在正常人的血清中，檢測不到或僅含極微量的ECPKA，而大部分癌癥病人的血清中ECPKA的表達水平卻很高，因此，血清ECPKA可作為人類各種癌癥的標記物，用于癌癥的檢測或監控病人對治療的反應。文檔編號G01N33/52GK101201351SQ20061014736公開日2008年6月18日申請日期2006年12月15日優先權日2006年12月15日發明者張瑞穩,慧王申請人:中國科學院上海生命科學研究院