專利名稱：用于測定神經毒素多肽的量及其催化活性和蛋白酶解活性的手段和方法
技術領域：
本發明屬于用于確保多肽生產和質量控制的工具領域。具體來說，本發明涉及在含有已加工好的神經毒素多肽和部分加工的或未加工的神經毒素多肽的溶液中確定加工好的(活性)神經毒素多肽的量的方法。本發明還涉及用于測定所述量的裝置以及適用于實施本發明方法的試劑盒。
背景技術：
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破傷風梭菌(Clostridium tetani)產生強效的神經毒素，即分別為肉毒桿菌毒素(BoNTs)和破傷風毒素(TeNT)。這些梭菌神經毒素(CNTs)特異地和神經元細胞結合并破壞神經遞質的釋放。每種毒素合成為無活性的、 未加工的約150kDa的單鏈蛋白質。翻譯后的加工包括二硫鍵的形成、以及由細菌蛋白酶進行的有限的蛋白酶解(切割)。活性神經毒素由通過二硫鍵相連的兩條鏈組成，一條約 50kDa的N-端輕鏈和一條約IOOkDa的重鏈。CNTs在結構上和功能上由3個結構域組成， 即具有催化功能的輕鏈、包含移位結構域(translocation) (N-端的半部分)和受體結合結構域(C-端的半部分)的重鏈，見 Krieglsteinl990，Eur J Biochem 188,39 ；Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202，41 ；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒桿菌毒素被合成為包含150kDa神經毒素蛋白和相關非毒性蛋白的分子復合物。復合物的大小根據梭菌的菌株和獨特的神經毒素血清型而不同，在300kDa、大于500kDa和900kDa之間變化。 這些復合物中的非毒性蛋白具有穩定神經毒素、保護其不被降解的作用，見Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19—S26。肉毒梭菌分泌7種抗原性上獨特的肉毒桿菌毒素(BoNT)血清型，稱為血清型A至 G。所有這些血清型與破傷風梭菌分泌的相關破傷風神經毒素(TeNT) —起是Zn2+內切蛋白酶，它們通過切割SNARE蛋白來阻斷突觸的胞吐，見Couesnon，2006，Microbiology，152， 759。CNTs導致見于肉毒中毒和破傷風的弛緩性肌肉癱瘓，見Fischer 2007, PNAS 104， 10447。盡管具有毒性效應，肉毒桿菌毒素復合物已被用作許多疾病的治療劑。肉毒桿菌毒素血清型A于1989年在美國被批準人用以治療斜視、瞼痙攣以及其它疾病。它在商業上以肉毒桿菌毒素A蛋白制劑獲取，例如，在商業名BOTOX (Al Iergan公司)或商業名DYSP0RT (Ipsen公司)下。一種改進的、無復合的肉毒桿菌毒素A制劑可以以商業名 XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)商業獲得。作為治療用途，該制劑被直接注射到需要治療的肌肉中。在生理PH值時，該毒素從蛋白質復合物中被釋放出來并產生期望的藥理學效應。肉毒桿菌毒素的效應只是短暫的，這正是為什么可能需要反復施用肉毒桿菌毒素以維持治療效果的原因。梭菌神經毒素減弱隨意肌的強度，是對斜視、局灶性肌張力障礙，包括頸部張力障礙、和良性特發性瞼痙攣有效的療法。它們還已經被證實可以緩解半面痙攣和局灶性強直，此外，在例如胃腸道病癥、多汗癥以及美容抗皺修復等其它廣泛的適應癥中有效，見Jost 2007,Drugs 67,669。在梭菌神經毒素的生產過程中，活性神經毒素多肽的定性和定量確定及其質量控制非常重要。目前可獲得的神經毒素制劑除了包含所需要的活性(已加工好的或成熟的) 神經毒素之外，還包含未經蛋白酶解加工的前體和/或部分加工的神經毒素多肽。未經蛋白酶解加工的前體或部分加工的神經毒素多肽和成熟的(活性的、已加工好的)神經毒素多肽在序列上只有少數幾個氨基酸的差異。因此，很難根據它們的化學和物理特性將其定量地區分開來。另一方面，在這類制劑中，未經蛋白酶解加工的前體和/或部分加工的神經毒素多肽在總蛋白中所占的部分可能仍然顯著。該部分取決于用于生產的生物系統，并是發酵過程中的生物合成和反應條件的結果。因此，在神經毒素制劑中所需要的成熟、具有生物活性的神經毒素多肽的含量是預先規定的，并且目前非常難以確定。迫切需要用于成熟(活性)神經毒素多肽的可靠定性和定量檢測系統的工具和方法，這些工具和方法目前還不可獲得。因此，本發明的技術問題可以看做提供滿足上述需要的工具和方法。該技術問題通過在權利要求和下文中描述的實施方案得到了解決。

發明內容
本發明涉及一種在含有已加工好的神經毒素多肽和部分加工的和/或未加工的神經毒素多肽的溶液中確定已加工好的(活性)神經毒素多肽的量的方法，包括以下步驟a)使上述溶液的第一部分與特異性結合成熟神經毒素多肽、部分加工和未加工神經毒素多肽的輕鏈的第一捕獲抗體，在允許所述抗體結合到所述成熟神經毒素、部分加工的和未加工的神經毒素多肽的條件下接觸，從而形成第一抗體復合物，b)使第一抗體復合物與檢測抗體接觸，從而形成第一檢測復合物，其中所述檢測抗體特異性結合步驟a)中形成的抗體復合物中的所述成熟神經毒素、部分加工和未加工神經毒素多肽的重鏈，c)使上述溶液的第二部分與特異性結合所述部分加工和未加工神經毒素多肽的接頭的第二捕獲抗體，在允許所述抗體結合到所述部分加工和未加工神經毒素多肽的條件下接觸，從而形成第二抗體復合物，d)使第二抗體復合物與檢測抗體接觸，從而形成第二檢測復合物，e)測定步驟b)和d)中形成的第一和第二檢測復合物的量。f)根據步驟e)中確定的第一和第二檢測復合物的量，計算成熟神經毒素多肽的量。上述方法通常可以包含另外的步驟，包括溶液的配制步驟或關于進一步評價步驟 f)中所獲得的結果的步驟。此外，步驟a)和b)以及步驟c)和d)可以同時或相繼地進行。 在后一種情況下，步驟a)和b)可以在步驟c)和d)之前或之后進行。另外，在步驟e)中提及的測定在所述情況下可以在兩個步驟系列均已經完成之后進行，或者步驟e)中的測定就第一檢測復合物而言在步驟a)和b)之后進行，而關于第二檢測復合物的測定在步驟 c)和d)之后進行。該方法可以部分或完全地借助自動化技術完成。孵育和測量步驟可以由例如機器人來執行。數據分析和解釋可以通過計算機執行的算法來進行。本發明中所使用的術語“神經毒素多肽”指肉毒桿菌神經毒素的7個不同的血清型(即 BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G)、和破傷風神經毒素 (TeNT)(見表1)、以及它們的變體。表1、肉毒桿菌神經毒素和破傷風神經毒素
SEQ ID NO:參考文獻登錄號神經毒素(全長)/ 細菌菌林17Beecher 1997, J Protein Chem 16， 701-712.; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49-57.ABD65472.1 GI:89258592BoNT/A (Hall/62A)18Antharavally 1998, J Protein Chem 17, 417-428.BAE48264.1 GL81230332BoNT/B (Okra)19Sagane 1999, J Protein Chem 18, 885-892.BAA89713.1 GI: 6729213BoNT/Cl (C-6814)20Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892.BAA90661.1 GI:6939795BoNT/D (CB16)21Antharavally 1997, J Protein Chem 16， 787-799.CAA43999.1 GI: 403 94BoNT/E (Beluga)22Sagane 1999, J Protein Chem 18, 885-892.CAA73972.1 GI:3805790BoNT/F (NCTC10281)23Campbell 1993, Biochim. Biophys. Acta 1216 (3), 487-491CAA52275.1 GI:441276BoNT/G24Krieglstein 1991，Eur J Biochem 202, 41-51.; Krieglstein et al. 1990, Eur J Biochem 188, 39-45.P04958.2 GI: 135624TeNT 本文述及的神經毒素原則上包含N-端輕鏈和C-端重鏈。神經毒素作為單鏈前體分子產生，在此被稱為“未加工的神經毒素多肽”。在未加工的神經毒素中，N-端輕鏈和 C-端重鏈序列之間間隔至少一個蛋白酶解切割位點。這些神經毒素可以包含位于輕鏈和重鏈序列之間的接頭序列，其中輕鏈位于自第一切割位點起的N-端，而重鏈位于自第二切割位點起的C-端。在本發明的一方面，所述的接頭具有SEQ ID NOs :1至16中任何一個所示的氨基酸序列。在神經毒素的加工過程中，接頭序列將被切除。這些神經毒素包含兩個蛋白酶解切割位點，其中一個位于接頭序列的N-末端，另一個位于接頭序列的C-末端。在這類神經毒素的加工過程中，可能產生只在其中一個切割位點切割的中間產物，即接頭序列不被切除而是保留在N-端輕鏈或C-端重鏈上。該中間產物在本說明書中被稱為“部分加工的神經毒素多肽”。其它的神經毒素可以僅包含一個切割位點。對這些神經毒素而言， 可以理解，接頭序列不能被切除。然而，未加工的神經毒素能夠通過完整的蛋白酶解切割位點及側翼序列被免疫識別。這些側翼序列和切割位點在本發明中也被認為是一種接頭。因此，在此所使用的和上述的術語“接頭”，對于具有兩個切割位點的神經毒素多肽，是指輕鏈和重鏈序列之間的序列，或者對于僅具有一個切割位點的神經毒素多肽，是指切割位點及側翼序列。加工的結果是得到“已加工好的神經毒素多肽”。所述的加工好的神經毒素多肽表現出神經毒素特有的生物學特性，即(a)受體結合，(b)內化，(C)跨內體膜移位到細胞溶膠中，和/或(d)內切蛋白酶解切割參與突觸小泡膜融合的蛋白質。因此，已加工好的神經毒素多肽在本文中有時候稱作活性或成熟神經毒素多肽。神經毒素多肽的生物學活性， 在一方面，源于所有上述生物學特性。評價生物學活性的體內試驗包括小鼠LD50分析以及離體小鼠半月鬲分析，如 Pearce et aL.禾口 Dressier et al. (Pearce 1994，Toxicol Appl Pharmacol 128 :69_77 和 Dressier 2005, Mov Disord 20:1617-1619)所描述的。生物學活性通常表示為小鼠單位(Mouse Units，MU)。如在此所使用，IMU是腹膜內注射后將殺死規定的一個小鼠群體中的50%小鼠的神經毒性成分的量，即小鼠i. p. LD50。
在本發明方法的一方面，所述的神經毒素多肽選自a)具有SEQ ID NOs 17至24 任何之一所示氨基酸序列的神經毒素多肽，以及b)具有與SEQ ID NOs 17至24的任何之一所示的神經毒素多肽的氨基酸序列至少40%相同的氨基酸序列的神經毒素多肽。上述氨基酸序列顯示未加工的神經毒素多肽。相應的部分加工的或已加工好的神經毒素多肽的序列可以通過下面表3中提供的切割位點的信息，從上述序列推導出來。在本發明的另一方面，神經毒素多肽具有與SEQ ID NOs :17至24所示氨基酸序列至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同的氨基酸序列。本發明中所使用的“相同”/ “同一”是指氨基酸序列的序列一致性，其中序列被比對以得到最高級別的匹配。這可以通過利用編寫在例如BLASTP， BLASTN, FASTA (Altschul 1990，J Mol Biol 215，403)等計算機程序中的公開技術或方法來實現。在一方面，同一性百分比數值在整個氨基酸序列上計算。技術人員可以獲得基于各種算法的一系列程序來比對不同序列。在本文中，Needleman和Wunsch或Smith和 Waterman的算法給出特別可靠的結果。可以使用PileUp程序(1987，J Mol Evolution 25， 351 ；Higgins 1989 CABIOS 5，151)或 GCG 軟件包(Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)中的組件Gap和BestFit程序(Needleman and Wunsch 1970, J Mol Biol 48 ；443 ；Smith and Waterman 1981, Adv Appl Math 2， 482)進行序列比對。在本發明的一方面，使用GAP程序在整個序列區域上確定上述以百分數(％ )表示的序列同一性值，其中采用下述設置空位權重(Gap Weight) :50、長度權重 (Length Weight) 3,5F^KK (Average Match) 10. 000>5F^ItK (Average Mismatch) 0. 000，除非另有說明，這些參數應總是用作序列比對的標準設置。可以理解的是，在本發明的一方面，上述變體應該保留神經毒素的至少一種生物學特性，以及在一個方面，本文所描述的神經毒素多肽的所有生物學特性。在另一方面，變體可以是具有改進或改變了的生物學特性的神經毒素，例如，它們可以包含在酶的識別上被改善的切割位點、或可以在受體結合或以上述及的任何其它特性上被改進。可想到的是，本發明的概念依賴于神經毒素多肽的輕鏈和重鏈之間兩個或更多個切割位點的存在，而切割位點的性質以及它們之間的具體氨基酸序列并不重要，只要其特異于部分加工或未加工的神經毒素多肽即可。因此，另一方面是替換神經毒素多肽的重鏈和輕鏈之間的蛋白酶識別位點和接頭肽。
在另一方面，依照本發明方法的神經毒素多肽可以是嵌合分子。所述嵌合分子，在一方面，可以是單結構域被取代的。因此，在另一方面，神經毒素重鏈的部分被抗體的FC結構域的部分取代。本發明的方法中所使用的術語“量”涵蓋多肽的絕對量、相對量或所述多肽的濃度、以及與其相關或能從其衍生出的任何值或參數。在此所用的術語“溶液”是指包含成熟神經毒素多肽以及其部分加工和/或未加工的神經毒素多肽前體的任何溶劑體系。此外，該溶劑體系還包含溶劑。在本發明的各個方面，溶劑涵蓋水、水性緩沖體系、有機溶劑和離子液體。在本發明的一方面，其是水性溶劑體系。此外，溶劑體系，除了成熟的神經毒素多肽和部分加工或未加工的前體神經毒素多肽以及溶劑以外，可以還包含其它分子，包括其它細菌多肽。在一方面，在本發明的方法中應用的溶液為細菌細胞培養物或來源于該細菌細胞培養物的部分純化或純化了的制品。依照本發明的方法所使用的術語“部分”，是指溶液的試樣或等分試樣。在本發明的方法的一方面，本發明所提及的第一部分和第二部分在其體積和內容上是基本相同的。 這可以通過例如測定第一和第二部分中的總蛋白含量來達成，其中基本上一致的總蛋白含量指示第一和第二部分具有基本上相同的內容。然而，在另一方面，作為第一或第二部分被使用的部分可以是溶液的試樣或等分試樣的稀釋液。應理解的是，根據要被測定的神經毒素多肽(即部分加工或未加工神經毒素多肽或總的神經毒素)的量，可能需要進行稀釋以允許最優的定性和定量測定。怎樣進行這樣的稀釋為本領域技術人員所熟知。依照本發明的方法所使用的術語“接觸”是指(i)使上述捕獲抗體和溶液中包含的神經毒素、或(ii)使抗體復合物和檢測抗體在物理上接近以致其可以發生物理和/或化學相互作用。允許特異性相互作用的合適的條件為技術人員所熟知。所述條件將取決于本發明的方法中所要使用的抗體和溶液，并且能夠很容易被技術人員進行適應性調整。此外， 足以允許相互作用的時間也能夠被技術人員很容易地確定。此外，可以理解的是，在本發明的方法中所描述的各單個接觸步驟之間，可以進行洗滌步驟以獲得對接觸合適的條件。例如，在步驟a)中的第一抗體復合物形成之后，在將檢測抗體應用于所述抗體復合物之前， 應該除去剩余的溶液。此外，在步驟b)中的第一檢測復合物形成之后，在步驟c)中測定第一檢測復合物的量之前，可能需要除去剩余的(未復合的)檢測抗體。相應地，這當然同樣適用于步驟d)至f)。本文所使用的“抗體”涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、合成抗體、或任何所述抗體的片段。所述抗體的片段包括Fab、Fv或scFv片段，或這些片段任何一個的化學修飾衍生物。抗體可以用例如Harlow and Lane" Antibodies,A Laboratory Manual"，CSH Press,Cold Spring Harbor，1988 中所描述的方法來制備。單克隆抗體可以用最初在Kiihler 1975，Nature 256，495 中、以及 Galfr el981,Meth Enzymol 73，3中所描述的技術制備。該技術包含將小鼠骨髓瘤細胞與來源于免疫后的哺乳動物的脾細胞相融合。可以進一步利用本領域熟知的技術對抗體進行改進。例如，BIACORE(R)系統中所使用的表面等離子體共振可以被用于提高和表位結合的噬菌體抗體的效率，見Schier 1996，Human Antibodies Hybridomas 7，97 ；Malmborg 1995，J. Immunol Methods 183，7。 在此所使用的抗體還包括抗體的功能等同物，即能夠特異地結合到神經毒素多肽的期望表位或部分的試劑。在一方面，這種功能等同物包括在本說明書其它地方提及的受體或結合
8蛋白、或其能夠介導所述特異性結合的結構域。根據本發明的方法，“第一捕獲抗體”特異地結合包含在成熟神經毒素多肽的輕鏈中的、以及包含在部分加工和/或未加工的神經毒素多肽中的表位。在此所使用的特異性結合，通常是指抗體不與待測定的神經毒素多肽的重鏈或接頭上的或其它多肽上的其它表位產生顯著的交叉反應。在此所指的特異性結合能夠以各種熟知的技術來測試，包括例如競爭性實驗以及Western印跡。依照本發明所使用的表位涉及到被抗體識別的抗原決定簇。在另一方面，可以用不同的捕獲抗體來替代第一捕獲抗體。為此，至少一種捕獲抗體可以特異地結合未加工的神經毒素多肽的輕鏈上的表位，至少一種其它的捕獲抗體可以特異地結合部分加工的神經毒素多肽的輕鏈上的表位，以及至少一種其它的捕獲抗體可以特異地結合已加工好的神經毒素多肽的輕鏈上的表位。可以理解的是，對于本發明方法的目的，這三類抗體在功能上類似于第一捕獲抗體。類似地，特異地結合部分加工的和未加工的神經毒素多肽的輕鏈表位的捕獲抗體能夠與特異地結合到已加工好的神經毒素多肽的輕鏈表位的捕獲抗體組合使用。在一方面，所述的第一捕獲抗體應該是被固定的。所述的抗體的固定化，原則上， 在一方面，可以通過將抗體可逆或不可逆、直接或間接(通過接頭分子)地結合到固相支持物上來實現。在一方面，在執行本發明方法之前，第一捕獲抗體是固定的。在另一方面，在第一抗體復合物形成之后但在該復合物與檢測抗體接觸之前，第一捕獲抗體是固定的。用于固相支持物的材料為本領域技術人員熟知，包括例如可商業獲得的多糖基質，選自S印harose、S印hadex、瓊脂糖、Sephace、微纖維素、以及藻酸鹽珠；多肽基質、聚苯乙烯珠、膠乳珠、磁珠、膠態金屬粒、玻璃、塑料和/或硅片和表面、硝酸纖維素條，膜、薄片、 Duracytes、反應盤的孔和壁、塑料管。在本發明的一方面，所述的固相支持物用射線輻照的聚苯乙烯制成。術語“第一抗體復合物”是指包含特異地結合到加工好的、部分加工的或未加工的神經毒素多肽上的第一捕獲抗體的復合物。如上所述，所述的抗體復合物的形成是第一捕獲抗體與含有所述已加工好的、部分加工的和/或未加工的神經毒素多肽的溶液相接觸后的結果。根據本發明的方法，“第二捕獲抗體”特異地結合到包含未加工和/或部分加工的神經毒素多肽或其部分的接頭的表位上。在沒有接頭序列的情況下，可以考慮，所述第二捕獲抗體特異地結合到包含未經切割的蛋白酶解切割位點或其部分的表位上。在本發明的一方面，第二捕獲抗體不與已加工好的神經毒素多肽發生顯著的交叉反應。在一方面，所述的第二固定化的捕獲抗體特異地結合到基本上由SEQ ID NO :1至16所示的氨基酸序列(見以下表2或表3)組成的、或包含、或包含于該氨基酸序列的表位上。表2、不同神經毒素多肽的切割位點及側翼序列的氨基酸序列
權利要求
1.一種在含有已加工好的神經毒素多肽和部分加工和/或未加工的神經毒素多肽的溶液中確定加工好的神經毒素多肽量的方法，包括以下步驟a)使所述溶液的第一部分與第一捕獲抗體接觸，從而形成第一抗體復合物，其中所述第一捕獲抗體特異性結合加工好的、部分加工和未加工的神經毒素多肽的輕鏈，其中所述接觸在允許所述抗體結合到所述神經毒素上的條件下進行，b)使第一抗體復合物與檢測抗體接觸，從而形成第一檢測復合物，其中所述檢測抗體特異性結合步驟a)形成的抗體復合物中的所述加工好的、未加工的和部分加工的神經毒素多肽的重鏈，c)使所述溶液的第二部分與第二捕獲抗體接觸，從而形成第二抗體復合物，其中所述第二捕獲抗體特異性結合所述部分加工的或未加工的神經毒素多肽的接頭，其中所述接觸在允許所述抗體結合到所述部分加工的或未加工的神經毒素多肽上的條件下進行，d)使第二抗體復合物與檢測抗體接觸，從而形成第二檢測復合物，e)測定步驟b)和d)中形成的第一和第二檢測復合物的量。f)根據步驟e)中測定的第一和第二檢測復合物的量，計算成熟神經毒素多肽的量。
2.一種在含有已加工好的神經毒素多肽和部分加工和/或未加工的神經毒素多肽的溶液中測定加工好的(活性)神經毒素多肽量的方法，包括以下步驟a)使所述溶液的第一部分與第一捕獲抗體接觸，從而形成第一抗體復合物，其中所述第一捕獲抗體特異性結合成熟神經毒素多肽、部分加工的和未加工的神經毒素多肽的重鏈，其中所述接觸在允許所述抗體結合到所述成熟神經毒素、部分加工的和未加工的神經毒素多肽上的條件下進行，b)使第一抗體復合物與檢測抗體接觸，從而形成第一檢測復合物，其中所述檢測抗體特異性結合步驟a)形成的抗體復合物中的所述成熟神經毒素、部分加工的和未加工的神經毒素多肽的輕鏈，c)使所述溶液的第二部分與第二捕獲抗體接觸，從而形成第二抗體復合物，其中所述第二捕獲抗體特異性結合所述部分加工的和未加工的神經毒素多肽的接頭，其中所述接觸在允許所述抗體結合到所述部分加工的和未加工的神經毒素多肽上的條件下進行，d)使第二抗體復合物與檢測抗體接觸，從而形成第二檢測復合物，e)測定步驟b)和d)中形成的第一和第二檢測復合物的量。f)根據步驟e)中測定的第一和第二檢測復合物的量，計算成熟神經毒素多肽的量。
3.權利要求1或2的方法，其中所述第一捕獲抗體是固定化的。
4.權利要求1至3的任何一項中的方法，其中所述第二捕獲抗體是固定化的。
5.權利要求1至4的任何一項中的方法，其中步驟f)中的計算包括從所測定的第一檢測復合物的量中減去所測定的第二檢測復合物的量。
6.權利要求1至5的任何一項中的方法，其中所述第二捕獲抗體特異地結合具有SEQ ID NO 1至16中任何一個所示的氨基酸序列的肽表位。
7.權利要求1至6的任何一項中的方法，其中所述神經毒素多肽選自a)SEQ ID NO 17至24中任何一個所示的神經毒素多肽；以及b)具有與a)中的神經毒素多肽的氨基酸序列至少40%相同的氨基酸序列的神經毒素多肽。
8.權利要求1至7的任何一項中的方法，其中所述方法還包括測定神經毒素多肽的結合活性。
9.權利要求8的方法，包括以下步驟a)使含有神經毒素多肽的溶液的一部分與標記的肽接觸，從而形成復合物，以及b)根據標記物，測定步驟a)中形成的所述復合物，其中，復合物的存在、缺乏或其量指示所述溶液中的神經毒素多肽的結合活性。
10.權利要求1至9的任何一項中的方法，其中所述方法還包括測定神經毒素多肽的蛋白酶解活性。
11.權利要求10的方法，包括以下步驟a)使含有神經毒素多肽的溶液的一部分與具有通式X-對硝基苯酰胺的化合物接觸， 其中X為精氨酸或具有序列“精氨酸-Y”的肽，其中Y代表一個或多個氨基酸，以及b)根據與神經毒素多肽的量相關的、步驟a)中釋放的對硝基苯胺的量，確定所述溶液中神經毒素多肽的蛋白酶解活性。
12.一種測定溶液中已加工好的神經毒素多肽的量的裝置，包括a)第一捕獲抗體、第二捕獲抗體和檢測抗體的布置，其中所述布置允許權利要求1至 11之任何一項的方法的步驟a)至e)得以實施；以及b)計算工具，其中所述工具根據利用a)中的布置測定的第一和第二檢測復合物的量， 計算成熟神經毒素多肽的量。
13.一種適用于執行權利要求1至11之任何一項的方法的試劑盒，所述試劑盒包括a)第一捕獲抗體、第二捕獲抗體和檢測抗體的布置，其中所述布置允許權利要求1至 11之任何一項的方法的步驟a)至e)得以實施；b)計算工具，其中所述工具根據利用a)中的布置測定的第一和第二檢測復合物的量， 計算成熟神經毒素多肽的量，c)執行所述方法的說明書。
全文摘要
本發明屬于用于確保多肽生產和質量控制的工具領域。具體來說，本發明涉及在含有已加工好的神經毒素多肽和部分加工的或未加工的神經毒素多肽的溶液中確定加工好的(活性)神經毒素多肽的量的方法。本發明還涉及用于測定所述量的裝置以及適用于實施本發明方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK102414564SQ201080018544
公開日2012年4月11日 申請日期2010年4月23日 優先權日2009年4月27日
發明者J·弗里德里希, M·普法伊爾 申請人:莫茨制藥有限及兩合公司