專利名稱：一種IgG含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥分析檢測領(lǐng)域，特別涉及一種牛初乳中IgG含量的檢測方法。
技術(shù)背景
牛初乳是母牛產(chǎn)仔后72小時內(nèi)分泌的乳汁，在以往生產(chǎn)實踐中，往往被當(dāng)成沒有作用的東西拋棄，在現(xiàn)今科學(xué)研究中證明，初乳中的IgG含量非常的高，可到達(dá)59-80mg/ ml，有很高的利用價值。
目前國內(nèi)主要的檢測IgG含量的方法有單項免疫擴(kuò)散法、HPLC法、電泳法，但是精確度并不高，有著較大的誤差。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種精確度高、操作簡單的IgG含量的檢測方法。
一種IgG含量的檢測方法，它包括如下步驟
1、將標(biāo)準(zhǔn)IgG溶于緩沖液中配制成多個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別檢測每個標(biāo)準(zhǔn)溶液中的紅細(xì)胞基數(shù)后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線2、將樣品IgG與過量濃度的SPA混合反應(yīng)，制備IgG-SPA復(fù)合物；
3、將IgG-SPA復(fù)合物與過量豬血清補體反應(yīng)，產(chǎn)生的補體結(jié)合物與紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)，計算紅細(xì)胞基數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照即得樣品IgG含量。
其中，優(yōu)選地，所述步驟1中標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的制作方法如下首先制備IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液在緩沖液中溶解IgG標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別配制成為lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml、 0. 05mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后通過IgG-SPA結(jié)合反應(yīng)及補體結(jié)合反應(yīng)得到紅細(xì)胞數(shù)量，從而制備標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
其中，優(yōu)選地，步驟2中制備IgG-SPA復(fù)合物的方法為首先采用緩沖液配制與步驟1中標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)濃度的樣品溶液，放入超聲波清洗機中超聲2-20min，精確吸取 20-200ul樣品備用；然后采用緩沖液配制5倍以上IgG樣品溶液濃度的SPA溶液，放入超聲波清洗機中超聲2-20min，精確吸取20_200ul SPA備用；將備用的IgG與備用的SPA溶液進(jìn)行對應(yīng)混合，反應(yīng)生成IgG-SPA復(fù)合物。
其中，優(yōu)選地，步驟3中將IgG-SPA復(fù)合物與過量豬血清補體反應(yīng)，產(chǎn)生的補體結(jié)合物與紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)的步驟為首先采用緩沖液配制5倍以上IgG樣品溶液濃度的血清補體溶液，放入超聲波清洗機中超聲2-20min，精確吸取20_200ul血清補體溶液備用； 然后將步驟2中的IgG-SPA復(fù)合物與備用的血清補體溶液反應(yīng)生成補體結(jié)合物；再精確吸取20-200ul補體結(jié)合物與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)。
其中，優(yōu)選地，所述的緩沖液為PH6. 0的0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer, PB)。
有益效果本發(fā)明通過IgG分子的Fc段與SPA (Staphylococcal protein Α)葡萄球菌A蛋白發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生的復(fù)合物可與標(biāo)準(zhǔn)豬血清中的補體發(fā)生補體結(jié)合反應(yīng)，使特定濃度的紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液發(fā)生溶血反應(yīng)，通過紅細(xì)胞計數(shù)對比來檢測IgG含量，該檢測方法檢測結(jié)果精確，成功彌補了 IgG檢測領(lǐng)域中不同檢測方法誤差大的缺點，能精確的檢測初乳 IgG的含量，對產(chǎn)品的開發(fā)和品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用，同樣此方法可以應(yīng)用到其他免疫蛋白的檢測中，對其他生物制藥行業(yè)及保健品行業(yè)有著重要的推動作用。


圖1為實施例1的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其以標(biāo)準(zhǔn)液濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以紅細(xì)胞基數(shù)N (個)為縱坐標(biāo)，
其中，A點為實施例1中紅細(xì)胞基數(shù)與對應(yīng)濃度的坐標(biāo)點；
圖2為實施例2的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其以標(biāo)準(zhǔn)液濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以紅細(xì)胞基數(shù)N (個)為縱坐標(biāo)，
其中，B點為實施例2中紅細(xì)胞基數(shù)與對應(yīng)濃度的坐標(biāo)點；
圖3為實施例3的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其以標(biāo)準(zhǔn)液濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以紅細(xì)胞基數(shù)N (個)為縱坐標(biāo)，
其中，C點為實施例3中紅細(xì)胞基數(shù)與對應(yīng)濃度的坐標(biāo)點。
具體實施方式
下述實施例中緩沖液的配制方法0. 2mol/L的磷酸氫二鈉和0. 2mol/L磷酸二氫鈉，按照7 1的體積比混合成0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液，PH值調(diào)至6. 0。
標(biāo)準(zhǔn)IgG采用Sigma公司提供的純度彡95%的IgG標(biāo)準(zhǔn)品。
IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液采用標(biāo)準(zhǔn)IgG與磷酸鹽緩沖液按照濃度lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml 分別配置。
實施例1
一種IgG含量的檢測方法，其包括如下步驟
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定將標(biāo)準(zhǔn)IgG溶于緩沖液中配制IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為Img/ ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml，采用 IgG-SPA 補體結(jié)合法測定，紅細(xì)胞基數(shù)分別為177、403、742、1632、2980。最低檢出含量為0. 005mg。
將樣品IgG用緩沖液精確配制成lmg/ml的IgG樣品溶液，精確吸取IOOul置于樣品管中，放入超聲波清洗器中混合15min。配制5倍IgG樣品溶液濃度的SPA溶液，在樣品管中與IgG樣品溶液充分混合，進(jìn)行IgG-SPA復(fù)合反應(yīng)，為了加快反應(yīng)，可以放入超聲波清洗器中混合IOmin生成IgG-SPA復(fù)合溶液。同時配制5倍IgG樣品溶液濃度的豬血清補體液，與上述IgG-SPA復(fù)合溶液混合，進(jìn)行補體結(jié)合反應(yīng)，為了加快反應(yīng)，可以放入超聲波清洗器中混合8min，精確吸取IOOul補體結(jié)合反應(yīng)后溶液與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢測液發(fā)生溶血反應(yīng)，并進(jìn)行紅細(xì)胞基數(shù)為611，對照圖1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，基數(shù)611對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0. 3mg/ml,即lmg/ml的IgG樣品溶液與0. 3mg/ml的IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgG含量相同， 即 0. 3mg/ml*0. 95 = 0. 285mg/lm，0. 285/1*100%= 28. 50%，即待測樣品液中 IgG 含量為 28. 5%。
實施例2
一種IgG含量的檢測方法，其包括如下步驟
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定將標(biāo)準(zhǔn)IgG溶于緩沖液中配制IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為Img/ ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml，采用 IgG-SPA 補體結(jié)合法測定，紅細(xì)胞基數(shù)分別為204、398、750、1666、3202。最低檢出含量為0. 008mg。
將樣品IgG用緩沖液精確配制成0. 5mg/ml的IgG樣品溶液，精確吸取200ul置于樣品管中，放入超聲波清洗器中混合5min。配制7倍IgG樣品溶液濃度的SPA溶液，在樣品管中與IgG樣品溶液充分混合，進(jìn)行IgG-SPA復(fù)合反應(yīng)，為了加快反應(yīng)，可以放入超聲波清洗器中混合20min生成IgG-SPA復(fù)合溶液。同時配制7倍IgG樣品溶液濃度的豬血清補體液，與上述IgG-SPA復(fù)合溶液混合，進(jìn)行補體結(jié)合反應(yīng)，為了加快反應(yīng)，可以放入超聲波清洗器中混合lOmin，精確吸取IOOul補體結(jié)合反應(yīng)后溶液與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢測液發(fā)生溶血反應(yīng)，并對紅細(xì)胞基數(shù)為1140，對照圖2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，基數(shù)1140對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 0. 152mg/ml,即0. 5mg/ml的IgG樣品溶液與0. 152mg/ml的IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgG含量相同， 即 0. 152mg/ml*0. 95 = 0. 1444mg/lm，0. 1444/0. 5*100%= 28. 88%,即待測樣品液中 IgG 含量為28. 88%。
實施例3
一種IgG含量的檢測方法，其包括如下步驟
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定將標(biāo)準(zhǔn)IgG溶于緩沖液中配制IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為Img/ ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml，采用 IgG-SPA 補體結(jié)合法測定，紅細(xì)胞基數(shù)分別為Igl、377、756、1647、3120。最低檢出含量為0. 007mg。
將樣品IgG用緩沖液精確配制成0. 25mg/ml的IgG樣品溶液，精確吸取20ul置于樣品管中，放入超聲波清洗器中混合lOmin。配制10倍IgG樣品溶液濃度的SPA溶液，在樣品管中與IgG樣品溶液充分混合，進(jìn)行IgG-SPA復(fù)合反應(yīng)，為了加快反應(yīng)，可以放入超聲波清洗器中混合5min生成IgG-SPA復(fù)合溶液。同時配制10倍IgG樣品溶液濃度的豬血清補體液，與上述IgG-SPA復(fù)合溶液混合，進(jìn)行補體結(jié)合反應(yīng)，為了加快反應(yīng)，可以放入超聲波清洗器中混合2min，精確吸取20ul補體結(jié)合反應(yīng)后溶液與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢測液發(fā)生溶血反應(yīng)，并對紅細(xì)胞基數(shù)為1855，對照圖3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，基數(shù)1855對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 0. 076mg/ml,即0. 25mg/ml的IgG樣品溶液與0. 076mg/ml的IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgG含量相同， 即 0. 076mg/ml*0. 95 = 0. 0722mg/lm，0. 0722/0. 25*100%= 28. 88%，即待測樣品液中 IgG 含量為28. 88%。
需要說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種IgG含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)將標(biāo)準(zhǔn)IgG溶于緩沖液中配制成多個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別檢測每個標(biāo)準(zhǔn)溶液中的紅細(xì)胞基數(shù)后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；(2)將樣品IgG與過量濃度的SPA混合反應(yīng)，制備IgG-SPA復(fù)合物；(3)將IgG-SPA復(fù)合物與過量豬血清補體反應(yīng)，產(chǎn)生的補體結(jié)合物與紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)，計算紅細(xì)胞基數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照即得樣品IgG含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(1)中標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的制作方法如下首先制備IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液在緩沖液中溶解IgG標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別配制成為lmg/ml、 0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml,0. 05mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后通過IgG-SPA結(jié)合反應(yīng)及補體結(jié)合反應(yīng)得到紅細(xì)胞數(shù)量，從而制備標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟⑵中制備IgG-SPA復(fù)合物的方法為首先采用緩沖液配制與步驟(1)中標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)濃度的樣品溶液，放入超聲波清洗機中超聲2-20min，精確吸取20_200ul樣品備用；然后采用緩沖液配制5倍以上IgG樣品溶液濃度的SPA溶液，放入超聲波清洗機中超聲2-20min，精確吸取20_200ul SPA備用； 將備用的IgG與備用的SPA溶液進(jìn)行對應(yīng)混合，反應(yīng)生成IgG-SPA復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(3)中將IgG-SPA復(fù)合物與過量豬血清補體反應(yīng)，產(chǎn)生的補體結(jié)合物與紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)的步驟為首先采用緩沖液配制5倍以上IgG樣品溶液濃度的血清補體溶液，放入超聲波清洗機中超聲2-20min，精確吸取20-200ul血清補體溶液備用；然后將步驟( 中的IgG-SPA復(fù)合物與備用的血清補體溶液反應(yīng)生成補體結(jié)合物；再精確吸取20-200ul補體結(jié)合物與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞發(fā)生溶血反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的檢測方法，其特征在于所述的緩沖液為PH= 6.0 的0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種IgG含量的檢測方法，屬于醫(yī)藥分析檢測領(lǐng)域。它包括樣品處理、樣品與SPA產(chǎn)生免疫復(fù)合物以及補體結(jié)合檢測步驟。本發(fā)明所述的IgG含量的檢測方法檢測結(jié)果精確，成功彌補了IgG檢測領(lǐng)域中不同檢測方法誤差大的缺點，能精確地檢測初乳IgG的含量，對產(chǎn)品的開發(fā)和品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用，同樣此方法可以應(yīng)用到其他免疫蛋白的檢測中，對其他生物制藥行業(yè)及保健品行業(yè)有著重要的推動作用。
文檔編號G01N33/531GK102507958SQ20111036220
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者卜英俊, 張慧東, 王彬, 陳芳, 顧培華 申請人:江蘇星馳生物科技有限公司