專利名稱：一種基于電化學DNA生物傳感器的Pb²⁺、Hg²⁺同時測定方法
技術領域：
本發 明屬于分析化學和化學傳感器技術領域，涉及ー種基于汞離子、鉛離子誘導DNA構型發生改變的電化學DNA傳感器的制備方法，并將所制備的傳感器應用于實際水體系兩種離子低濃度時的同時檢測及単獨檢測。該方法可有效分析重金屬離子在環境中的污染特點，構建環境污染事故的應急監測系統。
背景技術：
近年來，采用電化學傳感器方法對有毒重金屬離子的檢測已成為研究熱點之一。與基于生物催化(酶、微生物等)和免疫原理的生物傳感器相比，DNA除了能夠特異性識別小分子，還具有識別層十分穩定，受環境干擾和限制少，并且易于合成或再生以供重復利用等優點，諸多優勢使得電化學DNA傳感器作為ー種新型的檢測技術在環境監測領域有著廣闊的應用前景。汞離子和鉛離子作為“優先管理有害物質名単”上的兩種重要金屬離子，因能對人體及環境產生毒害影響而備受人們關注。如今發展迅速的電化學和光學傳感技術，如基于熒光探針、金納米粒子、DNA酶、半導體量子點和碳納米管等方法，因具有操作簡單、靈敏度高、分析成本低等優點，逐漸被廣泛應用于Hg2+和Pb2+的檢測。Tang等基于Hg2+對T-T堿基對結構的特異性識別作用，通過觀察嵌插劑插入到雙鏈DNA前后電化學信號的改變情況，作為檢測汞離子的依據。Chang等利用能與Pb2+特異結合的脫氧核酶和微制作電泳裝置制造了一種簡單、微型化和具有選擇性的DNA傳感器，對Pb2+的檢測濃度達到了 llnM。盡管這些方法都可以實現對Hg2+和Pb2+的選擇性檢測，但絕大部分都針對單一金屬離子進行研究，應用同一種DNA探針同時對兩種離子進行測量的方法卻鮮有報道。Liu等利用一條標記有熒光基團的DNA探針，基于汞離子和鉛離子引起DNA構型發生改變引起的光化學信號的變化情況，成功對Hg2+和Pb2+實現了同時檢測。但是該方法引入了有毒的NaCN掩蔽劑，并且存在較高的背景信號干擾和較低的靈敏度等缺點，因而在實際檢測中受到多方面因素的限制。如上所述，目前在利用電化學DNA傳感器對重金屬離子的檢測方面，仍缺乏對兩種及其以上金屬離子同時測定的研究，不利于實現多目標物的分析檢測，因而開發出ー種能同時檢測多種離子的傳感檢測技術，在完善我國現有檢測技術手段，構建污染事故應急監測系統方面具有現實意義。

發明內容
本發明的內容就是提供ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法，并通過弓I入掩蔽劑可以有效實現對兩種離子的檢測。本發明的技術方案如下基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法，包括以下步驟I電極的預處理與活化
將金電極在鹿皮拋光布上用Al2O3粉末拋光至鏡面，依次在こ醇和去離子水中超聲，然后在H2SO4溶液中進行活化處理，用去離子水沖洗干凈，用氮氣吹干，即可得到表面干凈的金電極。2 DNA修飾電極的制備將活化的金電極浸泡在一定濃度的DNA雜化溶液中，室溫下靜置4-5天。巰基修飾的DNA通過Au-S鍵作用自組裝于金電極表面，得到DNA修飾電極。3 DNA生物傳感器對不同単一金屬離子體系的檢測將DNA修飾電極在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中進行電化學阻抗測量，測完后用緩沖溶液淋洗，并分別放置在一定濃度的Hg2+、Pb2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+等溶液中作用，然后再進行電化學阻抗測量，比較作用前后阻抗值的變化。
4 DNA生物傳感器對Hg2+和Pb2+共存體系中的單獨檢測將DNA修飾電極分別依次放置在Hg2++cysteine及Hg2++cysteine+Pb2+溶液中，Pb2++G-DNA及Pb2++G-DNA+Hg2+溶液中作用，并分別對作用后的DNA修飾電極進行電化學阻抗測量，分別比較作用前后阻抗值的變化。與現有技術相比本專利技術具有以下優點I.本發明所采用的DNA序列可特異性識別Hg2+和Pb2+，能排除其它常見ニ價金屬離子對體系的干擾，對Hg2+和Pb2+的檢測具有較好的選擇性；2.本發明是通過Au-S鍵將DNA組裝于金電極表面，該方法得到的DNA膜表面結構高度有序，穩定性好，受環境干擾和限制少；3.本發明所采用的電化學交流阻抗法是研究電極界面現象的ー種重要手段，可靈敏的表征電極表面DNA構型的變化情況，能實現對Hg2+和Pb2+的高靈敏度檢測；4.本發明所米用的掩蔽劑-半胱氨酸和G-DNA均屬于生物試劑,不具有毒性。


圖I為裸電極(·)及DNA修飾電極(ロ)的阻抗譜圖。圖2為DNA膜與Hg2+(KT6M)和Pb2+(KT6M)作用前后的阻抗譜圖DNA膜(□)，與Hg2+ 作用(▲ )，Pb2+ 作用(·)。圖3為電荷傳遞電阻的變化值Λ Rct與Hg2+和Pb2+濃度對數關系曲線，(·)為空白對照。圖4為DNA修飾電極對不同金屬離子的Λ Rct響應情況。圖5為DNA修飾電極與加入掩蔽劑的金屬離子作用前后的阻抗譜圖，(A)DNA 膜(□ )，Cys+Hg2+( · )，Cys+Hg2+Pb2+( ▲ ) ;(B)DNA 膜(□ )，G_DNA+Pb2+( ·)，G-DNA+Pb2++Hg2+( ▲)。
具體實施例方式以下實施實例對本發明做更詳細的描述，但所述實施不構成對本發明的限制。實施例I :Hg2+單獨的檢測將制備的DNA修飾電極用緩沖溶液充分淋洗后，在K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]溶液中進行電化學阻抗測量。測完后洗凈電極，然后分別放置在不同濃度的H2+溶液中作用，用Tris-ClO4緩沖溶液沖洗后再進行電化學測量。作用前后DNA修飾電極膜電容和膜電阻等的變化見表I。表IDNA修飾電極與Hg2+作用前后的阻抗數據擬合結果
權利要求
1.ー種基于電化學DNA生物傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法，其特征在于包括以下步驟 (A)電極的預處理與活化 將金電極在拋光布上用Al2O3粉末拋光至鏡面，依次在こ醇和去離子水中超聲，然后在H2SO4溶液中進行活化處理，用去離子水沖洗干凈，用氮氣吹干，即可得到表面干凈的金電扱。
(B)DNA修飾電極的制備 將活化的金電極浸泡在一定濃度的雜化DNA溶液中，室溫下靜置4-5天。巰基修飾的DNA通過Au-S鍵作用自組裝于金電極表面，得到DNA修飾電極。
(C)DNA生物傳感器對不同単一金屬離子體系的檢測 將DNA修飾電極在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中進行電化學阻抗測量，測完后用緩沖溶液淋洗，并分別放置在一定濃度的 Hg2+、Pb2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+等溶液中作用，然后再進行電化學阻抗測量，比較作用前后阻抗值的變化。
(D)DNA生物傳感器對Hg2+和Pb2+共存體系中的單獨檢測 將DNA修飾電極分別依次放置在Hg2++cy steine及Hg2++cysteine+Pb2+溶液中，Pb2++G-DNA及Pb2++G-DNA+Hg2+溶液中作用，并分別對作用后的DNA修飾電極進行電化學阻抗測量，分別比較作用前后阻抗值的變化。
2.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(A)所述拋光布為鹿皮拋光布，Al2O3粉末粒徑為O. 05 μ m, H2SO4濃度為1M。
3.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(A)所述依次在こ醇、去離子水中超聲，超聲時間分別為3min。
4.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(A)所述電極用去離子水沖洗后，用高純N2吹干。
5.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(B)所述雜化DNA包含三部分巰基修飾的DNA片段，Pb2+特異性識別酶DNAzyme, Hg2+ 特異性識別 DNA 片段 substrate DNA。
6.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(B)所述雜化DNA溶液的濃度為10/3 μ Μ，溶液為高離子強度的Tris-ClO4緩沖溶液，pH = 7. 4。
7.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(B)所述DNA雜化的溫度為常溫，雜化時間為一天。
8.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(B)所述雜化后DNA與金電極作用時間為4-5天，溫度為室溫。
9.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(C)所述電化學阻抗測量在封閉的法拉第箱中進行，電化學阻抗測量采用三電極系統，其中Ag/AgCl (飽和KCl溶液)為參比電極，鉬絲為對電極。
10.根據權利要求I一種所述基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(C)所述K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]溶液的濃度為4mM。
11.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟(C)所述該傳感器只對Pb2+、Hg2+有選擇性，而對其它金屬離子無選擇性作用。
12.根據權利要求I所述ー種基于電化學DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時測定方法,其特征在于步驟Φ)所述G-DNA為Pb2+特異性識別DNA片段，濃度為10 μ Μ。
全文摘要
本發明涉及基于汞離子、鉛離子誘導DNA構型發生改變的電化學DNA傳感器的制備及其應用，屬于分析化學和化學傳感器技術領域。本發明通過設計含有兩部分功能區——能夠特異性識別汞、鉛兩種離子的DNA序列，并將其組裝于金電極表面制成電化學DNA生物傳感器。本發明所制備的傳感器既可應用于實際水體中汞離子和鉛離子單一體系的檢測，亦可通過引入掩蔽劑實現混合體系中兩種離子的單獨檢測。該DNA傳感器制備方法條件溫和，簡單方便，穩定性好，此外，該傳感器具有有高特異性、高靈敏度和高選擇性的優點，且操作簡單、檢測時無需標記。
文檔編號G01N27/02GK102721728SQ201110362079
公開日2012年10月10日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者劉新會, 成登苗, 李曉宏, 梁剛, 石柳 申請人:北京師范大學