專利名稱：膜聯蛋白a3在檢測酒精性肝纖維化中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及膜聯蛋白A3在檢測酒精性肝纖維化中的用途，具體涉及膜聯蛋白A3作為檢測酒精性肝纖維化分子標志的用途。
背景技術：
現代醫學研究發現，酒精性肝纖維化表現為肝臟內的慢性炎癥及進行性肝組織纖維化，隨著病程的進展會導致酒精性肝纖維化，是長期酗酒患者死亡的主要原因。有統計顯示，酗酒(酒精濫用和酒精依賴)已經成為當今世界一個重要的公共衛生問題；在美國，67%的成年人有飲酒習慣，7.4%的成年人酗酒，每年大約有10萬人死于酗酒；而在我國，隨著人們生活水平的提高和社交的日益頻繁，酒精性肝纖維化的發病率逐年增加，嚴重威脅國人的健康；同時，酒精性肝纖維化患者的預后不容樂觀，4 5年存活率仍然很低。酒精誘導的肝損傷是引起肝纖維化的一個重要原因，雖然肝纖維化的臨床表現目前已歸類較為清晰明確，但其早期診斷率，特別是酒精性肝纖維化發生早期階段的診斷仍有待提聞。目前，關于酒精因素是如何誘發肝纖維化的過程，最終導致肝纖維化發生，其中的分子機制研究尚很缺乏?，F已有研究表明，酒精能導致肝細胞膜、線粒體和細胞核的變化。酒精能引起肝細胞膜通透性的改變，使細胞膜的透性增加，同時導致細胞膜結構上的缺陷(Molleken, Sitek et al.2009),且酒精還能導致細胞表面的磷脂總量增加，引起細胞表面電荷密度升高和脂質過氧化物酶體的增多(Szachowicz-Petelska, Dobrzynska etal.2008)。當前還有研究發現,酒精還能通過激活caspase-9和caspase-3途徑來啟動細胞的凋亡(Dan，Popov et al.2005)。因此，酒精影響肝細胞的機制是非常復雜的，需要利用高通量的辦法尋找在酒精性肝纖維化發生、發展過程中的標志分子，從而為深入闡述酒精性肝纖維化的發病機制，最終篩選和開發以治療和診斷為目的的酒精性肝纖維化相關差異表達的基因或/和蛋白質，本領域迫切需要新的在酒精性肝纖維化中差異表達的基因或/和蛋白質。膜聯蛋白A3 SwissProt的登錄號為ANXA3_RAT，細胞質膜上有分布，其為膜聯蛋白家方矣成員之一(參見 http://myhits.vital-1t.ch/cg1-bin/view sea entry name =sw:ANXA3_RAT&view_sw = UniProt);該蛋白家族在細胞生長和信號轉導方面發揮調節作用。所述的膜聯蛋白A3的功能在于抑制磷脂酶A3裂解成肌醇I，2-循環磷酸鹽和1-磷酸肌醇，同時在抗凝血方面也發揮作用。迄今為止，尚未見有關膜聯蛋白A3與酒精性肝纖維化直接或間接相關的報道。

發明內容
本發明的目的是提供膜聯蛋 白A3的新的用途，具體涉及膜聯蛋白A3用作檢測酒精性肝纖維化的分子標志的用途。本發明的另一個目的在于提供膜聯蛋白A3特異性的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，該特異性的抗體在制備檢測酒精性肝纖維化制劑中的用途。本發明的再一個目的在與提供一種抗膜聯蛋白A3的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，在制備檢測酒精性肝纖維化試劑盒中的用途。本發明通過篩選在酒精性肝纖維化和正常肝臟的肝非實質細胞中差異表達的蛋白質，獲得一種在酒精性肝纖維化和正常肝臟非實質細胞中存在差異表達的蛋白質(酒精性肝纖維化細胞中低表達)，經質譜鑒定為膜聯蛋白A3 ;進一步的免疫印跡實驗證實，該蛋白質在酒精性肝纖維化和正常肝臟的肝非實質細胞中存在蛋白質表達水平的差異(酒精性肝纖維化細胞中表達下調)；基于膜聯蛋白A3與酒精性肝纖維化的相關性，以該蛋白的轉錄本作為一個分子標志對其轉錄水平進行定量檢測可用作檢測酒精性肝纖維化。本發明的目的通過下述技術方案實行:本發明以改良的蔗糖密度梯度離心的方法收集離體實驗動物正常肝臟和酒精性肝纖維化的肝非實質細胞，裂解獲得細胞蛋白質后，以蛋白質二維凝膠電泳的方法分離蛋白質，通過ImageMaster軟件分析表達差異的蛋白質，并對所獲得的差異蛋白質進行質譜鑒定，結果顯示，膜聯蛋白A3在酒精性肝纖維化的肝非實質細胞中低表達；免疫印跡反應實驗進一步證實，膜聯蛋白A3在肝纖維化的肝非實質細胞中的低表達；實驗結果表明，膜聯蛋白A3可作為酒精性肝纖維化的分子標志，對其表達量進行檢測可以用來檢測酒精性肝纖維化；進一步，可制備檢測酒精性肝纖維化制劑。本發明中，采用蔗糖密度梯度離心的方法首先分離肝非實質細胞，再以酶解的方式獲得肝非實質細胞的質膜蛋白質；本發明中，通過二維凝膠電泳方法分離裂解得到的蛋白質,通過ImageMaster 2DPlatinum 6.0軟件分析,篩選得到差異表達的蛋白質，用戴安納升級液相色譜Ultimate3000串聯高容量離子阱 質譜(LC-MS/MS)進行分離鑒定；實驗鑒定獲得14種非冗余蛋白質在正常肝臟和酒精性肝纖維化肝臟的非實質細胞中差異表達，其中包括在肝纖維化的肝非實質細胞中表達降低的膜聯蛋白A3表達量；質譜分析獲得的膜聯蛋白A3的鑒定情況結果如表I所示。表1:膜聯蛋白A3的詳細鑒定結果
權利要求
1.膜聯蛋白A3在制備檢測酒精性肝纖維化制劑中的用途。
2.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用途是檢測膜聯蛋白A3在肝非實質細胞中的表達量，所述的膜聯蛋白A3為酒精性肝纖維化的檢測分子標志。
3.按權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的用途是檢測膜聯蛋白A3在肝非實質細胞中轉錄是否存在下調。
4.膜聯蛋白A3的特異性的抗體在制備檢測酒精性肝纖維化制劑中的用途。
5.按權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的特異性的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.抗膜聯蛋白A3的抗體在制備檢測酒精性肝纖維化試劑盒中的用途。
7.按權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抗膜聯蛋白A3的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.—種體外檢測酒精性肝纖維化肝非實質細胞中膜聯蛋白A3表達異常的方法，其特征在于，其包括步驟: (1)采用特異性抗體檢測待檢肝非實質細胞中膜聯蛋白A3蛋白的數量； (2)將步驟(I)所得到的數量與正常肝臟肝非實質細胞中膜聯蛋白A3的數量進行比較；測得的結果低于正常值，表示被檢樣本中膜聯蛋白A3的表達異常。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及膜聯蛋白A3在檢測酒精性肝纖維化中的用途。本發明通過篩選在酒精性肝纖維化和正常肝臟的肝非實質細胞中存在差異表達的蛋白，獲得在酒精性肝纖維化的肝非實質細胞中低表達的蛋白質——膜聯蛋白A3(ANXA3)，經免疫印跡實驗進一步證實了所述ANXA3在酒精性肝纖維化的肝非實質細胞中有較低的表達水平。實驗結果證實，所述的膜聯蛋白A3可作為分子標志用作檢測酒精性肝纖維化；所述的膜聯蛋白A3的特異性的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，可用于制備檢測酒精性肝纖維化制劑；所述的抗膜聯蛋白A3的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，可用于制備檢測酒精性肝纖維化試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK103116028SQ20111036618
公開日2013年5月22日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者張麗軍, 袁正宏, 馬芳, 賈小芳, 姚亞敏, 劉曉茜 申請人:上海市公共衛生臨床中心