專利名稱：一種利用uplc快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用UPLC技術快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，屬于液相色譜分析技術領域。
背景技術：
茄尼醇是一種無環四倍半萜醇，1956年首先從烤煙中提取并進行了結構鑒定。茄尼醇是一種天然化合物，廣泛存在于哺乳動物、高等植物和微生物體內，尤其以煙草中含量最高。茄尼醇在生物化學中具有重要作用，具有非常強的吸收自由基的性能，本身可起到抗菌、消炎、止血抗潰瘍作用和較強的抗癌活性，因此是藥物合成的重要原料和泛醌類藥物 (如輔酶Q10、維生素K2和抗癌增效劑等)不可替代的關鍵中間體，具有極重要的醫藥開發價值。同時，茄尼醇作為煙草類脂組分中含量最高的組分，關于其對煙草品質和安全性影響的研究很早就引起了人們廣泛的關注。煙草中的茄尼醇在煙草燃燒過程中，一部分直接轉移到主流煙氣中，一部分熱解產生多種香氣成分，有利于煙香味的改善，但另一方面，也會裂解產生多環芳烴(如致癌物PAHs)等有害物質，對煙草制品的安全性具有很大影響。
目前，關于茄尼醇提取和純化的研究比較成熟，多已形成專利。近年來，涉及茄尼醇的專利申請件有201010523040. 6號《一種超聲酶法輔助提取茄尼醇的方法》、 200910234074. 0號《一種高純度茄尼醇的制備方法》、200810058493. 9號《一種利用茄尼醇粗膏精制高純度茄尼醇的方法》、200710034942. 1號《從廢次煙草中同時提取高純天然煙堿和茄尼醇的方法》、200510104279. 9號《從霉碎煙末中提取茄尼醇的預處理方法》、 200410022233. 8號《一種茄尼醇的精制方法》、93106316. 7號《用霉煙或碎煙末提取茄尼醇的工藝方法》等。
茄尼醇是長鏈半萜烯醇化合物，采用有機合成的手段制備非常困難，目前只能主要依靠從煙草中提取獲得。因此，建立一種高效、精確的快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，對于煙葉中茄尼醇的提取純化和煙葉安全性研究具有非常重要的現實意義。煙葉中的茄尼醇提取方法主要是溶劑萃取，常用的萃取方式有索氏提取、熱回流萃取、機械震蕩萃取、超聲波萃取、超臨界流體萃取和微波萃取等。煙葉中的茄尼醇測定方法主要有薄層掃描法、氣相色譜法、液相色譜法和庫侖滴定法等，其中薄層掃描法常用作定性研究為主，氣相色譜法一般需要先對樣品進行衍生化處理，步驟繁瑣，庫侖滴定法一般和薄層分離組合使用，步驟也較繁瑣。液相色譜法是測定茄尼醇含量應用較多的一種方法，但多使用乙腈、甲醇、乙醇等兩種以上的洗脫劑作為流動相，其與萃取液(丙酮、甲醇等有機溶劑)組成的差異，會對色譜峰形造成影響，影響定量的準確性。
本發明采用分析速度更快、流動相用量更省的超高效液相色譜(UPLC)技術對茄尼醇進行分析，將常規液相色譜分析需要約20min才能完成的分析時間縮短為5min，大大節約了分析時間和有機試劑用量；同時，方法對色譜的流動相組成等分析條件進行了優化，將煙草樣品用甲醇溶液萃取過濾后，同樣使用甲醇作為流動相，直接進行超高效液相色譜分離測定，在與標樣進行比對保留時間定性的同時，采用比較標樣和樣品的質譜圖的方式對分析方法共流出的干擾峰進行了檢測和排除，建立了煙葉中茄尼醇含量的UPLC分析技術。實踐證明，該方法操作簡便、快速準確、靈敏度高，重現性好。目前尚無煙葉茄尼醇含量檢測方法的技術專利申請。發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術之不足，提供一種快速測定煙葉中茄尼醇含量的UPLC分析方法，該方法的提取方法簡單，檢測操作簡便，靈敏度高，重現性好，能準確、 快速地測定煙葉樣品中茄尼醇的含量。
實現本發明的技術方案是一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，將煙葉研磨成粉末，稱取50mg，將其置于50mL離心管中，加入25mL甲醇溶液，將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取lOmin，取2mL萃取液，經0. 22 μ m濾膜過濾得到的清液，用超高效液相色譜進行分析，測定煙葉中茄尼醇含量。
本發明所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，超高效液相色譜的分析條件為ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜-二極管陣列檢測器，配Empower 2色譜工作站，色譜柱型號BEH C18，l. 7μπι，2. ImmX 50mm，色譜柱流動相為100%甲醇等度洗脫，流速為0. 4mL/min,柱溫30°C，進樣量2 μ L，檢測波長為207nm，運行時間5min。
本發明所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，超高效液相色譜可串聯有三重四級桿-飛行時間質譜。
本發明所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，三重四級桿-飛行時間質譜分析條件為大氣壓化學電離源，正離子模式檢測，電暈電流4 μ A，電暈針溫度 5000C，采樣錐孔電壓30V，提取錐孔電壓4V，源溫120°C，錐孔氣流速50L/Hr，脫溶劑氣流速 800L/Hr，采用MS模式，全掃描質荷比范圍為100-1000，掃描時間5min。
本發明與現有技術相比，達到的有益效果
(1)建立了一個分析方法，此方法具有準確性、靈敏度高及重現性好等特點，可以快速檢測煙葉中茄尼醇的含量。
對茄尼醇標準溶液進行液相色譜分析，對峰面積(Y)與濃度(X，μ g/mL)進行線性回歸，得回歸方程Y = 2. 11X104X+4. 12X103，r2 = 0.99924。實驗結果表明，該方法在 0. 765 76. 5μ g/mL濃度范圍內有良好的線性關系。以信噪比計算知茄尼醇的檢測限為 7. 65ng/mL，遠遠低于實際煙草樣品中茄尼醇的含量，說明本方法的靈敏度高；
稱取50. OOOOmg相同初烤煙葉的煙末樣品10份，分成兩組，每組5份。其中一組按照本發明的實驗條件平行測定5次，計算方法的重復性；另外一組樣品分別加入0. 68mg 的茄尼醇標準品，根據標樣加入量、加標前后樣品的測定量計算回收率。結果表明茄尼醇的精密度測定1^0%為2.62%，回收率為91. 1%，說明本發明的方法準確性較高，重復性較好。
(2)本發明前處理方法簡單，對樣品萃取和分析的流動相采用同一種溶劑，不會對色譜峰造成影響，定量更準確。
(3)本發明分析方法采用了分析速度更快、流動相用量更省的超高效液相色譜技術，優化了流動相組成等分析條件，將常規液相色譜分析需要約15-20min才能完成的分析時間縮短為5min，大大節約了分析時間和有機試劑用量。
(4)本發明方法對分析目標采用了超高效液相色譜和三重四級桿-飛行時間質譜進行準確OhTOF-MQ定性和定量，排除了共流出雜質的干擾。
質譜比較定性法采用定性能力強的三重四級桿-飛行時間質譜Oi-TOF)對茄尼醇標準品和樣品進行了分析。在大氣壓化學電離源(APCI)、正離子模式下，使用TOF-MS對茄尼醇標準品和樣品進行分析，并比較了與二者對應的扣除各自基線背景的質譜圖。由圖可以看出，標準品和樣品質譜圖的特征離子峰一致，都是以m/z為613. 57的離子峰為基峰， 另外還存在豐度較低的m/z為631. 58的離子峰。
采用MassLynx 4. 1軟件對其分子式進行推測，得到m/z為613. 57的離子峰的分子式為C45H73，是茄尼醇(C45H74O)失去一個H2O分子的加氫離子峰([M-H2CHH]+離子)，m/z 為631. 58的分子式為C45H75O,即茄尼醇分子的加氫離子([M+H]+離子)。可見在APCI正離子分析模式下，茄尼醇上的羥基并不穩定，大部分極易失水脫去，形成脫水加氫離子峰，只有一小部分形成加氫離子峰。由實施例中的圖(2)可以確定本發明的色譜分離條件可以使樣品中的茄尼醇完全從基質中分離出來，未受到共流出雜質的干擾，本色譜條件分離效果良好。
說明書附圖


圖1 茄尼醇標準品(a)與煙樣提取樣品(b)的UPLC色譜圖對比圖。
圖2 茄尼醇標準品(a)與煙樣提取樣品(b)的質譜圖對比圖。
具體實施方式
本發明通過以下具體實例作進一步描述，但并不限制本發明。
實施例1
不同類型煙草樣品中茄尼醇含量的快速測定
一、測定儀器和實施條件
1. 1色譜儀器及條件:ACQUITYUPLC H-CLASS超高效液相色譜_ 二極管陣列檢測器 (PDA)，配 Empower 2 色譜工作站，UPLC-XEVO Q-T0F，美國 Waters 公司，配 MassLynx 4. 1 質譜軟件，色譜柱型號BEH C18(l. 7ym,2. ImmX 50mm)，美國Waters公司制造，色譜柱流動相為100%甲醇等度洗脫，流速為0. 4mL/min,柱溫30°C，進樣量2 μ L，檢測波長為207nm， 運行時間5min。
1. 2質譜條件大氣壓化學電離源(APCI)，正離子模式檢測，電暈電流4 μ A，電暈針溫度500°C，采樣錐孔電壓30V，提取錐孔電壓4V，源溫120°C，錐孔氣流速50L/Hr，脫溶劑氣流速800L/Hr，采用MS模式，全掃描質荷比(m/z)范圍為100-1000，掃描時間5min。
1.3輔助類儀器AB104-S型電子天平，感量O.OOOlg，瑞士 Merrier Toledo公司； T701DH型超聲波振蕩器，德國Elma公司；KS多用調速搖床振蕩器，北京科偉科技儀器有限公司；Milli-Q Element型超純水系統，美國Millipore公司；0. 22 μ m尼龍針式濾頭。
1.4試劑和樣品乙腈、甲醇、異丙醇為色譜純，美國默克公司；丙酮、無水乙醇等為分析純；茄尼醇對照品，純度為90%，廣州百靈威科技有限公司生產；煙葉樣品采集于貴州省某產區。
二、煙葉中茄尼醇含量的分析方法
2. 1樣品制備
將不同類型的初烤煙葉(共7份)、晾曬煙(共3份)和香料煙(共1份)的煙葉各自研磨成粉末，各稱取50. OOOOmg，將其分別置于50mL離心管中，各加入25mL甲醇溶液， 將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取lOmin，取2mL萃取液，經0. 22μπι濾膜過濾，以清液進樣分析。
2. 2茄尼醇標準曲線的制作
準確稱取5-10mg茄尼醇標準品，用甲醇溶解定容至濃度為150. 00 μ g/mL的標準儲備液，用甲醇稀釋配制成濃度為0. 765，1. 53，3. 825，7. 65，15. 30，30. 60，76. 50 μ g/mL的標準系列溶液。對茄尼醇標準溶液進行液相色譜分析，對峰面積(Y)與濃度(X，μ g/mL)進行線性回歸，得回歸方程Y = 2. 11X104X+4. 12X103，r2 = 0.99924。實驗結果表明，該方法在0. 765 76. 5 μ g/mL濃度范圍內有良好的線性關系，以信噪比為3計算知茄尼醇的檢測限為 7. 65ng/mL。
2. 3煙葉中茄尼醇的定性分析
2. 3. 1色譜保留值定性
色譜保留值定性法在相同的色譜條件下，當流速為0. 4mL/min，煙葉中分離譜圖中組分的色譜保留時間和對應的茄尼醇標準品的保留時間一致，均為2. 49min，且色譜柱壓較低，利于組分分離，說明煙葉中對應時間的組分為茄尼醇，見附圖1。
2. 3. 2質譜比較定性
質譜比較定性法采用定性能力強的三重四級桿-飛行時間質譜Oi-TOF)對茄尼醇標準品和樣品進行了分析。在大氣壓化學電離源(APCI)、正離子模式下，使用TOF-MS對茄尼醇標準品和樣品進行分析，并比較了與二者對應的扣除各自基線背景的質譜圖。
茄尼醇標準品(a)與煙樣提取樣品(b)的質譜圖對比，標準品和樣品質譜圖的特征離子峰一致，都是以m/z為613. 57的離子峰為基峰，另外還存在豐度較低的m/z為 631. 58的離子峰。
2. 4煙葉中茄尼醇的定量測定
在前述定性分析的基礎上，精確稱取煙葉樣品，提取、制備樣品溶液，按1. 1色譜條件，采用超高效液相色譜外標法定量，以茄尼醇標準品為相應外標物。三種不同類型煙葉樣品中茄尼醇含量的檢測結果見表1。
表1三種不同類型煙葉樣品中茄尼醇含量的測定結果
權利要求
1.一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于將煙葉研磨成粉末，稱取50mg，將其置于50mL離心管中，加入25mL甲醇溶液，將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取lOmin，取2mL萃取液，經0. 22 μ m濾膜過濾得到的清液，用超高效液相色譜進行分析，測定煙葉中茄尼醇含量。
2.根據權利要求1所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于超高效液相色譜的分析條件為ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜-二極管陣列檢測器，配Empower 2色譜工作站，色譜柱型號BEH C18，1. 7 μ m，2. ImmX 50mm,色譜柱流動相為100%甲醇等度洗脫，流速為0.4mL/ min，柱溫30°C，進樣量2yL，檢測波長為 207nm，運行時間5min。
3.根據權利要求1所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于超高效液相色譜可串聯有三重四級桿-飛行時間質譜。
4.根據權利要求3所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于三重四級桿-飛行時間質譜分析條件為大氣壓化學電離源，正離子模式檢測，電暈電流4μ A，電暈針溫度500°C，采樣錐孔電壓30V，提取錐孔電壓4V，源溫120°C，錐孔氣流速50L/Hr，脫溶劑氣流速800L/Hr，采用MS模式，全掃描質荷比范圍為100-1000，掃描時間 5min。
全文摘要
本發明公開了一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，將煙葉研磨成粉末，稱取50mg，將其置于50mL離心管中，加入25mL甲醇溶液，將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取10min，取2mL萃取液，經0.22μm濾膜過濾得到的清液，用超高效液相色譜進行分析，測定煙葉中茄尼醇含量，本發明具有提取方法簡單，檢測操作簡便，靈敏度高，重現性好，能快速、準確地測定煙葉樣品中茄尼醇的含量。
文檔編號G01N30/06GK102520079SQ201110367750
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者向章敏, 周淑平, 張婕, 汪云松, 耿召良, 蔡凱, 許冬青 申請人:貴州省煙草科學研究所