專利名稱：一種肝癌監測、分期以及預后風險評估的試劑及其方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及ー種監測患肝癌或肝纖維化風險的試劑或組合物
背景技術：
原發性肝癌(primarylivecarcinoma，PLC)，簡稱肝癌，包括原發性肝細胞癌、 膽管細胞癌、混合型癌、肝母細胞癌等，以原發性肝細胞癌為最常見。原發性肝細胞癌 (hepatocellularcarcinoma, HCC)是全球最常見的癌癥之一，也是近年來發病率上升最快、 病死率最高的腫瘤之一。毎年在全球肝癌發病人群中，中國患者占將近一半，在中國的癌癥死亡率中排名第二。當人們感染上乙型肝炎病毒(O^patitis virus B,HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)后常會導致慢性肝纖維化，并逐漸發展成肝硬化。統計數據顯示，60-80%的肝硬化患者會發展成肝癌。中國是HBV感染的高發國家，也是肝癌的高發地區，近年發病率呈緩慢上升趨勢，病死率也隨之上升，毎年死于晚期肝癌的病人約20萬人。其發病率之高也與我國肝炎病人居多有關，85%的肝癌患者是由病毒性肝炎引起的。HCC的早期患者一般多無臨床癥狀，或僅有肝炎的癥狀，很難早期發現。大約80%的肝癌患者一經發現就已到晚期， 人出現了食欲不振、消瘦、腹水、肝區疼痛、右上腹腫塊等典型癥狀，這些病人生存期大多在半年之內，而失去了進行根治性手術治療的機會。因此，早期診斷對肝癌的治療效果非常關鍵，對于患有慢性肝病和肝硬化的高危人群進行早期肝癌的篩查，從而進行根治性手術治療，可以有效的降低死亡率。目前有各種成像技術用于診斷肝癌，例如超聲波，CT掃描和核磁共振成像等。然而，這些技術不能區分肝癌和良性肝病變，如不典型增生結節和肝硬化微結節。超聲檢查通常難以發現、確認小于3cm的腫塊。目前臨床上最常用的肝癌標志物是甲胎蛋白(alpha-fetoproteir^AFP)，但是有相當一部分肝癌患者的AFP不升高，也有很多慢性肝炎和肝硬化患者出現AFP的升高。因此，AFP的敏感性和特異性都無法讓人滿意。上述現狀導致HCC難以實現早期發現和早期治療，患者預后差、5年生存率低、病死率高。因此，尋找有效的早期HCC篩查及診斷指標來提高的HCC患者的診斷治療水平迫在眉睫。目前，診斷肝硬化患者是否患有HCC可通過無創檢測，如影像對比、AFP檢測等方法來進行。治療后，醫生通過常規AFP檢測和影像檢查來確定腫瘤是否復發。當影像學手段無法達到診斷目的吋，還可以通過活檢來診斷。由于肝活檢對病人有一定的風險，因此肝活檢是不適合納入常規檢查，一般每半年一次來監測評估肝臟疾病的進展以及治療后腫瘤是否復發。由于AFP檢測的特異性不高，可產生一定的假陰性和假陽性，可能漏診一部分肝癌患者。因此，需要其他的血液標記方式來替代或輔助AFP檢測。糖蛋白分子由多肽鏈和糖兩部分組成。血清中大多數的糖蛋白是由肝臟和B淋巴細胞合成的。血清糖蛋白中N-糖苷鍵連接的寡糖鏈(簡稱N-寡糖鏈)的任何變化，可以反映肝細胞或B淋巴細胞的生理改變。近年來，糖組學研究顯示了 N-寡糖鏈的改變與各種腫瘤的發生和發展有密切的相關性(參考文獻1，Liu, X-E, Desmyter, L，Gao, C-F, Laroy, W, Dewaele, b, Vannooren, V, Wang, L, Zhuang, H, Callewaert, N, Libert, C, Contreras,R, Chen, C. N-Glycomic changes in hepatocellular carcinoma patients with liver cirrhosisinduced by hepatitis B virus. Hepatology，46，1426—1435，2007.)。鑒于肝癌早期預防和預后監測的不確定性，目前迫切需要一種有效地監測肝癌的試劑和監測評估方法。

發明內容
本發明涉及一種監測早期肝癌以及預后風險評估的組合物及其監測方法。在本發明中，我們確定了，血液糖蛋白的N-糖苷鍵連接的碳水化合物(N-寡糖)含量的改變，與早期肝癌患者的組織學的肝癌早期階段(Tl或1 之間存在顯著地相關性。在上述工作基礎上，我們發現了評估肝癌早期階段的臨床監測方法，對沒有任何臨床表現的患有肝疾病患者，包括肝纖維化患者，肝硬化患者和肝癌早期階段患者均可有效篩查，定期評估肝臟疾病的進展以及治療后腫瘤的復發。在本發明中，我們使用血清的N-寡糖鏈指紋技術(簡稱G-Test方法)作為診斷指標，對肝癌(HCC)患者進行了評估。研究表示，N-寡糖鏈指紋技術可作為診斷肝癌的腫瘤分期，同時這項檢測方法可以檢測出50%的AFP漏診的HCC病例。因此，將N-寡糖鏈指紋和AFP監測聯合使用，可以大大提高肝癌早期診斷的準確率。該方法可以讓眾多肝纖維化和肝硬化患者接受常規、無創檢測，幫助醫藥工作者早期檢測肝癌，并能夠及時監測疾病進展。本發明G-Test方法是基于檢測血液糖蛋白中N-寡糖鏈的指紋圖譜，創建的ー種 HCC的早期篩查及診斷的檢測方法和檢測系統。該方法主要步驟是，釋放并熒光標記血清或血漿樣品中的糖蛋白的N-寡糖鏈；分離測量樣本中熒光標記的N-寡糖鏈的含量或指紋圖譜(簡稱G-Test圖譜)；分析比較N-寡糖指紋圖譜，得到檢測指標參數。該方法可以讓眾多肝纖維化肝硬化患者接受常規、無創檢測，幫助醫生早期檢測肝癌，并能夠及時監測疾病的發生和發病的進展。一種監測患肝癌或肝纖維化風險的組合物，由選自下述的N-寡糖鏈組成NA3F、 NA2F、NA2FB、NGA2F、NGA2FB 以及 NA3。上述的組合物，可以由 NA3F、NA2F 和 NA2FB 組成；上述的組合物可用于制備肝癌早期診斷和肝癌分期檢測試劑。我們可以利用NA3F/ (NA2F+NA2FB)的比值來診斷早期肝癌診斷和肝癌分期檢測。一種診斷試劑，包括組合物，所述組合物由NGA2F、NGA2FB和NA3組成；所述的組合物在制備肝纖維化早期診斷或預后評估試劑中的應用；所述的組合物，通過(NGA2F+NGA2FB)/NA3的比值來監測肝纖維化。本發明還可以是ー種診斷試劑，其包括上述的組合物。材料和方法一、測試樣本本實驗共收集了 471例患者的血清，血清收集來自北京(佑安醫院，武警醫院，地壇醫院，北大醫院)，南京(南京第二醫院)和上海(瑞金醫院)，其中包括173例肝纖維化患者，218例HCC患者和80例肝硬化患者。健康對照組130例的血清來自北京紅十字會中心。以上患者均接受臨床實驗室分析診斷和組織學檢查(肝穿刺活檢)并符合以下選擇標準(a)均為HBV感染的患者(b)排除人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)、丙型(h印atitis C virus，HCV)、丁型(h印atitis D virus，HDV)、戊型 (hepatitisE virus HEV)肝炎病毒和梅毒(syphilis)等除乙型肝炎病毒感染之外的其他病毒感染；(c)排除自身免疫性肝病、酒精性肝病，藥物性肝病和Wilson病；血清采集均在患者未接受任何治療之前，臨床血常規、生化、腫瘤標志物、乙肝肝炎病毒標志物、DNA載量等數據與血清同期收集。丙氨酸轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)，總膽紅素，白蛋白，血清總蛋白和Y-谷氨酶(GGT)的測量數據用于評估病人的肝功能損害的程度。ニ、設備和試劑設備主要是ABI3130 DNA測序儀(Applied Biosystems美國生物應用公司)，以及用于 ABI3130 DNA測序儀的電泳毛細管(Capillary array36 厘米，Applied Biosystems 美國生物應用公司)，GeneMapper (ABI3130)分析軟件(Applied Biosystems美國生物應用公司)。試劑主要含有試劑A(變性緩沖液)10mM的碳酸氫銨pH值8. 35 % SDS ；試劑 B (PNGaseF反應緩沖液)=PNGaseF終濃度2. 2單位/ μ在3. 33 % ΝΡ40 ；試劑C (APTS標記緩沖液)混和同等體積的20mM APTS (容于1. 2M檸檬酸)和IM NaCNBH3 (容于DMS0)；試劑 D(唾液酸酶反應液)0. 25 μ 1 IOOmM NH4AC, pH 5 ;0· 2 μ 1 唾液酸酶(neuraminidase, 2mU), 2. 55 μ 1 雙氧水。三、檢測血清樣本中的G-Test圖譜的操作步驟N-寡糖鏈分析(G-Test圖譜分析)的操作程序保括四個步驟(a)用專ー性的 N-糖苷鍵水解酶制備自由寡糖鏈往稀釋一倍的4ul血清加入2 μ 1的試劑A，95°C加熱5 分鐘變性；然后同等體積的Gul)的試劑B，37°C反應3小時后干燥；(b)熒光標記自由寡糖鏈カ卩入2μ 1的試劑C，65°C加熱3小時進行熒光標記，然后加入200 μ 1的水終止標記反應；(c)去除末端唾液酸取2μ1熒光標記的(b)步驟的液體，然后加入2μ1的試劑D， 45°C加熱3小時進行去末端唾液酸反應，然后加入200 μ 1的水終止標記反應；(d)分離分析熒光標記的N-寡糖鏈取10 μ 1去末端唾液酸反應的(c)液體，用ΑΒΙ3130測序儀進行 N-寡糖鏈片分離，得到G-Test圖譜.四、檢測分析對測量得到的G-Test圖譜中的每個峰均進行量化計算，以每個峰的相對含量來表示(％)即用每個峰的峰高值除以所有峰的高度的總和來定量計算，計算得到G-HCC值和G-Fibrosis值。用統計學比較肝癌患者(HCC組)與健康對照組，纖維化組和肝硬化組的相對含量的差異。


圖l.G-Test系統方法應用于人血清的N-寡糖圖譜的分離和檢測。G-Test 方法的操作大致分為四個步驟；(1)樣品血清的收集和處理；( 標記與分離N-寡糖鏈；⑶分析N-寡糖鏈指紋或G-Test圖譜；(4)G-Test診斷參數對造.圖譜中的寡糖縮寫分別表示為NGA2F，半乳糖缺失含核心巖藻糖(al，6Fuc)兩天線(agalacto， core- α -1，6-fucosylatedbiantennary) ；NGA2FB,半乳糖缺失帶有二等分乙酰葡糖胺 (GlcNAc)修飾的核心巖藻糖(al，6Fuc)兩天線(agalacto，core- α -1,6-fucosylated bisecting biantennary) ；NA2F,核心巖藻 fe (, α 1,6Fuc)兩天線(bigalacto, core-a-1,6-fucosylated biantennary) ；NA2FB，帶有二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修飾的核心巖藻糖(α 1,6Fuc;兩犬線(bigalacto, core- α -1,6-fucosylated bisecting biantennary)； NA3，三天線(trigalacto, triantennary) ；NA3F，分支巖藻糖(a l，3/l，2Fuc)修飾的三天線(triga丄acto，α 1, 3/1, 2-fucosylated triantennary)。圖2.典型的人血清N-寡糖圖譜或G-Test圖譜。圖譜中的寡糖縮寫分別表示為 NGA2F，半乳糖缺失含核心巖藻糖(a l，6Fuc)的兩天線；NGA2FB，半乳糖缺失帶有二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修飾的核心巖藻糖(a l，6Fuc)兩天線；NG1A2F，半乳糖單ー缺失的核心石藻* α 1,6Fuc) 1^3^; (single agalacto, core-α -1,6-fucosylatea biantennary)； NA2，兩天線(bigalacto，biantennary) ；NA2F，核心巖藻糖(a l，6Fuc)兩天線；NA2FB，帶有二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修飾的核心巖藻糖(a l，6Fuc)兩天線；NA3，三天線；NA3F，分支巖藻糖(a l，3/l，2Fuc)修飾的三天線。圖3. N-寡糖圖譜與肝癌的相關性。與肝纖維化組和肝硬化組比較，圖表顯示肝癌患者(HCC組)寡糖的相對含量明顯的改變并具有統計學意義的相關性(ρ < 0. 0001)。纖維化(n = 173)；肝硬化組(n = 80) ；HCC組(n = 227).縱軸代表寡糖的相對值(％ )。圖4. G-HCC比值[NA3F/ (NA2F+NA2FB)]與肝癌的相關性.與肝纖維化組和肝硬化組比較，G-HCC比值明顯升高并具有統計學意義的相關性(ρ<0. 0001).纖維化(η= 173)； 肝硬化組(n = 80) ；HCC組(n = 227).縱軸代表寡糖的相對值(% )。圖5. G-HCC比值[NA3F/ (NA2F+NA2FB)]和AFP含量用于鑒別診斷原發性肝細胞癌 HCC 的 ROC 曲線。G-HCC 比值的 AUC = 0. 851，AFP 的 AUC = 0. 764。圖 6. G-HCC 比值[NA3F/ (NA2F+NA2FB)]和 AFP 含量(cutoff < 400ng/ml)與肝癌分級的相關性.圖6A顯示G-HCC比值與肝癌分級具有統計學意義，而圖6表示AFP含量與肝癌分級無線性關系.TMNO :n = 76(肝硬化組)；TMN1-2 :n = 22 ；TMN3-4 :n = 27。圖7.用于鑒別診斷原早期肝細胞癌Tl-T2(n = 34)與晩期肝細胞癌T3_T4(n = 64)的 ROC 曲線.G-HCC 比值的 AUC = 0. 854，AFP 的 AUC = 0. 778。圖8. N-寡糖圖譜與肝纖維化的相關性。圖表顯示，寡糖的相對含量的改變與纖維化發展成正比· Control 健康對照組(n = 130)；纖維化分期FO (Ishak score) (η = 44)； 纖維化分期F1-F2 (n = 43)；纖維化分期F3-F4 (n = 44)；纖維化分期F5-F6 (n = 42)；肝硬化組(η = 80) ；HCC組(n = 227).縱軸代表寡糖的相對值(％ )。圖9. G-Fibrosis比值[(NGA2F+NGA2FB) /ΝΑ3]與肝纖維化的分級成正比。 Control 健康對照組(n = 130)；纖維化分期FO (Ishak score) (η = 44)；纖維化分期 F1-F2 (n = 43)；纖維化分期 F3-F4 (n = 44)；纖維化分期 F5-F6 (n = 42)。
具體實施例方式以下將詳細說明本發明，但是實施方式并不限于以下方式。實施例1肝癌G-Test方法可檢測N-寡糖圖譜在肝癌患者中的變化我們對以上收集到的471例患者的血清進行了 G-Test方法分析，其操作如圖1所示大致分四個步驟(1)樣品血清的收集和處理；( 標記與分離N-寡糖鏈；C3)分析N-寡糖鏈指紋或G-Test圖譜；(4)G-Test各參數對照分析。如圖2所示，人血清的G-Test圖譜大概顯示出近10個N-寡糖鏈峰，不同的寡糖鏈因分子大小的不同而表現出不同的遷移性， 即表現在G-Test圖譜上的不同的峰則代表了不同的寡糖鏈；寡糖鏈的相對濃度含量則表現在所測出的峰高。我們對測量得到的G-Test圖譜中的每個峰均進行了量化計算，即以每個峰的相對含量來表示(％ )用每個峰的峰高值除以所有峰高值的總和。用統計學計算方法比較肝癌患者(HCC組)與健康對照組、纖維化組和肝硬化組的各N-寡糖鏈相對含量的差異。經過與健康對照組比較，所測出的HCC組中的N-寡糖鏈的峰的數量與對照組相同，但寡糖的相對含量有明顯的變化。與肝纖維化組和肝硬化組相比較，HCC組中含分支巖藻糖(a l，3/l，2Fuc)三天線(NA3F)所占比例顯著升高(P < 0. 0001)(見圖3A)，而含核心巖藻糖(al，6Fuc)的兩天線(NA2F)所占比例降低(P < 0. 0001)(見圖加)。盡管肝硬化患者的含核心巖藻糖(a l，6Fuc)和二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修飾兩天線(NA2FB)所占比例升高，但是HCC組與肝纖維化對照組沒有顯著差別(見圖3C)。鑒于60-80%的肝硬化患者會發展成肝癌，本發明的G-HCC肝癌的比值[NA3FバNA2F+NA2FB)]不僅顯示肝纖維化的參數同時也包含了肝硬化的參數。如圖4所示，HCC肝癌組的G-HCC肝癌的比值顯著的升高(ρ < 0.0001)。ROC(Receiver Operating Characteristics) Curve 分析顯示(圖 5)，其受試者用AFP檢測方法的AUC (Area Under the Curve)是0. 764，若用G-HCC肝癌的比值參數來檢測HCC，其AUC的臨床檢測值可達0. 851，比用AFP檢測方法的診斷效率提高了 8. 7%。同吋，本發明G HCC肝癌的比值[NA3F/ (NA2F+NA2FB)]較參考文獻1 (AUC的臨床檢測值為0. 812)更加敏感穩定，可以大大提高診斷的精確性。根據美國癌癥聯合會對肝癌的TMN分期法，HCC組分為TO無原發腫瘤；Tl無血管侵犯的實體腫瘤；T2腫瘤侵犯血管或多發腫瘤但都小于5cm ；T3多發腫瘤，大于5cm或腫瘤累及門脈或肝靜脈的分支；T4腫瘤直接侵犯鄰近器官(除了膽嚢)或內臟漿膜穿孔。其中，Tl和Τ2(ΤΜΝ1-2)級視為早期階段，而T3和T4(TMN3-4)則為肝癌的晩期。我們發現目前臨床使用的AFP檢測方法(AFP < 400ng/ml)與肝癌的發展沒有線性關系(見圖6B)，令人興奮的是G-HCC肝癌的比值與肝癌的發展成線性關系(見圖6A)，并具有統計學意義(ρ < 0.01), ROC Curve分析顯示(圖7)，AFP檢測方法區分HCC的早期T1-T2 (n = 34)與晚期Τ3-Τ4 (n = 64)的AUC值是0. 778，而G-HCC肝癌的比值顯示AUC = 0. 854，參考文獻1 的AUC值是0. 813，說明G-HCC肝癌比值的診斷效カ比目前臨床采用的AFP檢測方法以及現有技術的寡糖分期法有顯著性提高，該指標可用于更好的鑒別診斷HCC的分級。由此可見 G-HCC肝癌的比值方法檢測HCC的總體特異性和敏感性比AFP方法要好得多。實施例2G-Test分析方法可預測纖維化的發生和發展如圖表8所示，本發明的G-Test分析方法可用于檢測跟蹤肝疾病患者的纖維化發展。在纖維化患者中，半乳糖缺失的兩天線N-寡糖鏈(NGA2F+NGA2FB)的含量伴隨著肝纖維化的進展而呈線性升高(圖表8Α-Β)，與此同吋，三天線N-寡糖鏈(ΝΑ； )成線性降低趨勢(圖8C)。由此而產生檢測跟蹤纖維化發生發展的G-Fibrosis纖維化的比值 [(NGA2F+NGA2FB)/NA3]，半乳糖缺失的兩天線之總和與三天線的比值。G-Fibrosis纖維化的比值參數與纖維化發展成正比(圖9)。肝纖維化是肝內纖維結締組織的異常增生與沉積，是各種慢性肝病向肝硬化發展的必經階段。但是肝纖維化早期往往無明顯的臨床和影象學表現，目前，肝纖維化的診斷有賴于肝穿刺病理組織學檢查和血清學檢查。本發明用 G-Fibrosis纖維化檢測指標對肝纖維化的早期診斷，可有效的用于檢測跟蹤乙肝病毒攜帯者，從而可預測纖維化的發生和發展，在慢性肝病的早期治療和預后判斷中有重要意義。
上述雖然結合附圖對本發明的具體實施方式
進行了描述，但并非對本發明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。
權利要求
1.一種監測患肝癌或肝纖維化風險的組合物，其特征在干，所述組合物由選自下述的 N-寡糖鏈組成NA3F、NA2F、NA2FB、NA2G、NA2GF、NGA2F、NGA2FB 或 NA3。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在干，所述組合物由NA3F、NA2F和NA2FB組成。
3.權利要求2所述的組合物在制備肝癌早期診斷、肝癌分期或預后評估試劑中的應ο
4.如權利要求2所述的組合物，其特征在干，通過NA3FバNA2F+NA2FB)的比值來診斷早期肝癌和肝癌分期。
5.如權利要求1所述的組合物，其特征在干，所述組合物由NGA2F、NGA2FB和NA3組成。
6.權利要求5所述的組合物在制備肝纖維化早期診斷、分期或預后評估試劑中的應ο
7.如權利要求6所述的組合物，其特征在干，通過(NGA2F+NGA2FB)/NA3的比值來監測肝纖維化。
8.—種診斷試劑，其包括權利要求1或2或4或6或8所述的組合物。
9.權利要求8所述的診斷試劑，其特征在干，所述試劑與AFP檢測技術聯合應用。
全文摘要
本發明公開了一種監測患肝癌或肝纖維化風險的組合物，由選自下述的N-寡糖鏈組成NA3F、NA2F、NA2FB、NA2G、NA2GF、NGA2F、NGA2FB以及NA3。上述組合物可用作制備試劑，用于肝癌早期診斷、肝癌分期檢測或預后評估，還可以應用于肝纖維化早期診斷或預后評估。本發明還提供了一種監測患肝癌或肝纖維化風險的方法，可大大提高肝癌或肝纖維化診斷的靈敏性和穩定性，大大優于現有的AFP檢測技術。
文檔編號G01N33/50GK102565318SQ201210006489
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者陳翠英 申請人:陳翠英