專利名稱：薄層色譜法鑒別玉米須多糖的方法
技術領域：
本發明涉及玉米須多糖精的薄層色譜鑒別方法，屬于藥物鑒別領域。
背景技術：
玉米的“頭發”即玉米須(Stigma maydis)是禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭,是常用中藥。祖國醫學認為，玉米須味淡、性平，有利尿、平肝、利膽等功效。現代醫學研究認為，玉米須含脂肪油、皂苷、生物堿、黃酮類、維生素K3、抗壞血酸、有機酸等，具有利尿、降血壓、降血糖、利膽、止血、抑菌及增強免疫、抗癌等多種功效。已有學者對其水煎劑的降糖作用進行了研究，玉米須多糖在玉米須中含量為4%，是玉米須最主要的水溶性成分之一。大量試驗證明多糖具有抗病毒、增強免疫力、抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、抗凝血等多種功效。 而多糖中的色素將影響多糖的提精制及分析，所以要將多糖中的色素除去，提高多糖的藥理作用；粗多糖含有色素，還有很多蛋白質，影響多糖的純度及化學結構的分析，也影響其生物活性的研究。因此，對玉米須多糖進行鑒別實驗研究，為其結構及其構效關系等理論研究、工業化提供基礎數據。無錫工業大學湯魯宏等對玉米須多糖進行了系統研究，純化出4個多糖，加入 70% H2SO4，室溫下放置30min，加入去離子水，置100°C水浴中保溫水解16h，取出水解液， 冷卻至室溫后用BaCO3中和，過濾，濾液置50°C下減壓蒸干。用吡啶洗滌溶解后所生成的單糖，制備糖腈乙酸酯衍生物，用GC法進行測定。得到四個單糖的比例分別為CSPSLa-IA :甘露糖、葡萄糖、半乳糖(3 : I : I)。CSPSLa-2A:木糖、阿拉伯糖、甘露聚糖(I : 4 : 5)。 CSPSLa-IB :葡萄糖、半乳糖、甘露聚糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖(20 : 14 : I : I : I)。 CSPSLa-B :葡萄糖、半乳糖、甘露聚糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖(20 : 6 : 4 : I : 2 : 2)。河南科技學院李波等將熱水提取的玉米須樣品經2mol/L三氟乙酸水解，在溫度 121°C下水解lh，然后用PMPl-苯基3-甲基-5-吡唑啉酮進行柱前衍生化，用高效液相色譜儀進行分析，發現玉米須多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖所組成，它們的比例為 I : O. 89 : O. 48 O. 39 O. 34 0.26。長春工業大學王磊等用硫酸水解玉米須多糖，衍生后經GC檢測，初步鑒定玉米須多糖是由葡萄糖、木糖及鼠李糖三種單糖組成。南昌大學生命科學與食品工程學院食品科學系的周鵬等用水提取茶葉并采用凝膠純化，從茶葉中分離得到一種多糖蛋白復合物TGP. TGP被硫酸完全水解，單糖產物用鹽酸-羥胺和乙酸酐進行衍生化處理，GC-MS進行分析.研究結果表明，TGP的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。安徽大學生命科學院的廖紅梅等利用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)檢測5種常見單糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)的乙酰化產物含量。為在預衍生化中取得較高的效率，采用正交試驗綜合考察了還原時間、還原溫度、乙酰化溫度、乙酰化時間等因素對單糖回收率的影響及規律。結果表明，影響最為顯著的因子為還原溫度和乙酰化時間。總結出了單糖衍生化最佳的反應條件為還原溫度50°C、還原時間2. 5h ;乙酰化溫度90°C、乙酰化時間2. 5h。徐州工程學院食品學院的馬利華等對生姜多糖的體外抗氧化性進行了研究，并采用薄層色譜法分析生姜多糖的單糖組成。實驗討論了薄層色譜法中不同水解條件、不同展開系統、不同顯色劑對薄層色譜的影響。結果表明生姜多糖具有較強的自由基清除活性，其薄層色譜法中硫酸為最佳水解用酸，最適的顯色劑為苯胺-二苯胺磷酸顯色劑，得到生姜多糖的單糖組成為葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖。可見，在各種多糖組分分析中，GC-MS分析有著舉足輕重的地位，但由于多糖不易氣化必需對其進行水解，衍生化處理，薄層色譜由于其操作簡便，能夠準確鑒別而具有一定的實用性。未見采用薄層層析法鑒別玉米須多糖的報道。

發明內容
針對GC、HPLC的缺點及TLC的優點，本發明解決的技術問題在于，提供一種玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，能夠簡便、快速的鑒別玉米須多糖及其單糖的種類。利用薄層層析法分析玉米須多糖中單糖組分。通過對比玉米須多糖脫色前后薄層層析效果，調整展開劑配比，最終確定薄層層析法分析玉米須多糖的組成及其分析的最佳工藝條件。I.多糖水解取粗多糖Img溶于5ml 2mol/L三氟乙酸溶液中，置于反應釜中 120°C水解3h。冷卻后，真空抽濾得濾液，減壓旋干后加1.5ml50%乙醇溶解，得紅褐色溶液，即為水解后多糖樣品。2.由于玉米須多糖水解后含有大量色素而呈紅褐色，嚴重影響顯色效果，故需要在不破壞單糖結構的情況下，對玉米須多糖進行脫色。多糖脫色取水解后多糖樣品O. 5ml加入30uLH202，加熱70°C脫色lOmin。得淡黃色溶液，即為脫色后多糖樣品。3.單糖對照品分別配制不同濃度的D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖， α -鼠李糖，D-半乳糖標準溶液溶液。另各取D-葡萄糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，α -鼠李糖，D-半乳糖，D-半乳糖醛酸，D-木糖O. 3mL配得混合標準樣。4.薄層板取硅膠G4. 3g與15mL0. 5% CMC-Na鋪板。用前于105°C活化30min。5.展開劑展開劑一般是易揮發性的的溶液，故實驗時需要現用現配；展開劑I : 正丁醇甲醇氯仿冰醋酸水=12. 5 : 4. 5 : 5 : I. 5 : I ;展開劑2 :正丁醇甲醇氯仿冰醋酸水=12. 5 : 4. 5 : 9 : I. 5 : I ;展開劑3 :正丁醇乙酸乙酯 異丙醇水=7 4 7 2;展開劑4:正丁醇乙酸乙酯異丙醇水冰醋酸= 7:4:7:2:2.6.顯色劑苯胺二苯胺磷酸水丙酮=I. 4 I 12. 4 7. I 1447.薄層層析①點樣先用鉛筆在距離已活化的硅膠板底邊Icm處畫一條細線，并輕輕畫出點樣的起始點標記，在薄層層析中，點樣時的樣品溶液原點應盡可能的小，一般直徑不超過 3mm為宜。在點樣前還應將板邊緣約O. 5mm寬的涂層刮去，以免引起邊界效益。用毛細管吸取樣品，樣品溶液原點間距I. 5cm。②展開將配制好的展開劑置于層析缸里，待展開劑蒸汽在缸內飽和后將點好樣的薄層板底部向下輕輕斜置于層析缸里。待展開至頂端Icm時取出薄層板，晾干。③顯色將顯色劑導入浸潰槽中，把晾干的硅膠板迅速浸入顯色劑中并立即取出， 置于烘箱中125°C條件下4. 5min，取出，觀察并記錄現象。8.取步驟I中多糖水解液混合、步驟2中多糖脫色液與混合對照品在自然光下比較由附圖I和圖2可得出多糖脫色后比移值基本不變，說明其單糖的結構未被破壞，但脫色后有部分單糖斑點更加清晰，分離效果也有所提高，說明玉米須多糖的色素影響到單糖的展開及顯色，故此分析法分析多糖時需進行脫色，且效果較好。取步驟5中不同的展開劑，按步驟7，附圖3-6結果為當用展開劑I展開后，發現樣點分離效果不明顯，尤其是D-葡萄糖5，D_甘露糖6， L-阿拉伯糖的比移值很接近，調整展開劑組分比例后，有較大改善。當選用展開劑3和展開劑4時，發現樣品拖尾嚴重。展開劑選用正丁醇甲醇氯仿冰醋酸水=12. 5 : 4. 5 : 9 : I. 5 : 1，斑點顏色清晰，分離度好。玉米須多糖含有D-木糖、α -鼠李糖，L-阿拉伯糖，至少含有D-甘露糖、D-葡萄糖其中一種，另外還含有一種未知糖。本發明的優點為I.目前分析多糖的單糖組成常用氣相色譜法和液相色譜法。氣相色譜法有其優勢，但糖類本身揮發性低，必須在氣相色譜分析之前預先轉化為易揮發、熱穩定性好的衍生物，操作過程比較繁瑣，且某些單糖及糖醛酸不易檢出。液相色譜法色譜柱條件苛刻，成本高，不易普及。薄層色譜是中藥材常用的一種定性鑒別、分析方法，有許多優點，玉米須多糖首次采用薄層層析法鑒別。2.通過調制薄層板，多糖酸水解，以及采用脫色的方法處理樣品，配制不同展開劑等一系列實驗使斑點顏色清晰、分離度很好，最大限度減少雜質的干擾。3.本發明方法操作簡單，所用儀器設備和材料普及性好，便于對玉米須多糖進行組分分析。


圖I與圖2為脫色和未脫色與混合對照品化學位移值比較圖(自然光)圖3 :展開劑I多糖樣品脫色薄層色譜4 :展開劑2多糖樣品脫色薄層色譜5 :展開劑3多糖樣品脫色薄層色譜6 :展開劑4多糖樣品脫色薄層色譜I :1.未脫色多糖2.混合對照品圖2 :1.脫色多糖2.混合對照品圖3:1.多糖樣品(未脫色)2. D-半乳糖醛酸3. D-半乳糖4. D-葡萄糖5. D-甘露糖6. L-阿拉伯糖7. D-木糖8. α-鼠李糖9.多糖樣品(脫色)圖4 :1. D-半乳糖醛酸2. D-半乳糖3. D-葡萄糖4. D-甘露糖5. L-阿拉伯糖 6. D-木糖7. α -鼠李糖8.樣品(脫色)9.混合對照品圖5 :1. D-半乳糖醛酸2. D-半乳糖3. D-葡萄糖4. D-甘露糖5. L-阿拉伯糖6. D-木糖7. α -鼠李糖8.樣品(脫色)9.混合對照品圖6 :1. D-半乳糖醛酸2. D-半乳糖3. D-葡萄糖4. D-甘露糖5. L-阿拉伯糖
6.D-木糖7. α-鼠李糖8.樣品(脫色)9.混合對照品，
具體實施例方式實施例II.多糖水解取粗多糖Img溶于5ml 2mol/L三氟乙酸溶液中，置于反應釜中 120°C水解3h。冷卻后，真空抽濾得濾液，減壓旋干后加1.5ml50%乙醇溶解，得紅褐色溶液，即為水解后多糖樣品。2.多糖脫色取水解后多糖樣品O. 5ml加入30uLH202，加熱70°C脫色lOmin。得淡黃色溶液，即為脫色后多糖樣品。3.單糖對照品分別配制不同濃度的D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖， α -鼠李糖，D-半乳糖標準溶液溶液。另各取D-葡萄糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，α -鼠李糖，D-半乳糖，D-半乳糖醛酸，D-木糖O. 3mL配得混合標準樣。4.薄層板取硅膠G4. 3g與15mL0. 5% CMC-Na鋪板。用前于105°C活化30min。5.展開劑2 :正丁醇甲醇氯仿冰醋酸水=12. 5 : 4. 5 : 9 : 1.5 I ；6.顯色劑苯胺二苯胺磷酸水丙酮=I. 4 I 12. 4 7. I 1447.薄層層析①點樣先用鉛筆在距離已活化的硅膠板底邊Icm處畫一條細線，并輕輕畫出點樣的起始點標記，在薄層層析中，點樣時的樣品溶液原點應盡可能的小，一般直徑不超過 3mm為宜。在點樣前還應將板邊緣約O. 5mm寬的涂層刮去，以免引起邊界效益。用毛細管吸取樣品，樣品溶液原點間距I. 5cm。②展開將配制好的展開劑置于層析缸里，待展開劑蒸汽在缸內飽和后將點好養的薄層板底部向下輕輕斜置于層析缸里。待展開至頂端Icm時取出薄層板，晾干。③顯色將顯色劑導入浸潰槽中，把晾干的硅膠板迅速浸入顯色劑中并立即取出， 置于烘箱中125°C條件下4. 5min，取出，觀察并記錄現象8.取步驟5中的展開劑，按步驟7，結果為附圖4。
權利要求
1.薄層色譜法鑒別玉米須多糖，包括如下步驟①分別配制不同濃度的D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，α-鼠李糖，D-半乳糖對照品溶液。②取各對照品溶液混合為對照品混合溶液。③將水提醇沉玉米須粗多糖，Sevag+酶法脫蛋白，純度在30%以上，三氟乙酸水解，雙氧水脫色。50%乙醇溶解，得樣品溶液。④取各糖對照品溶液、樣品溶液和對照品混合溶液進行薄層色譜分析，在于對照溶液和對照品混合溶液色譜相同的位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則樣品不含有該糖。
2.根據權利要求I所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于，所用水解的酸為三氟乙酸，濃度為2mol/L。
3.根據權利要求I所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于，置于反應釜中120°C水解3h。
4.根據權利要求I所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于，步驟的具體操作為取各糖對照品溶液、樣品溶液和對照品混合溶液，分別點于同一硅膠薄層板上，以展開劑展開，取出，晾干，顯色，烘干，在于對照溶液和對照品混合溶液色譜相同的位置上，樣品溶液顯相同顏色的斑點。
5.權利要求4中所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于，所述展開劑為正丁醇甲醇氯仿冰醋酸水。
6.權利要求4中所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于，所述展開劑體積比正丁醇甲醇氯仿冰醋酸水=12. 5 : 4. 5 : 9 : 1.5 I。
7.權利要求4中所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于顯色劑為苯胺二苯胺磷酸水丙酮。
8.權利要求4中所述的玉米須多糖的薄層色譜鑒別方法，其特征在于顯色劑體積比為苯胺二苯胺磷酸水丙酮=1.4 I 12.4 7. I 144。
全文摘要
本發明涉及一種薄層色譜法鑒別玉米須多糖的方法，屬藥品鑒別技術領域，主要內容如下以硅膠G和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制得薄層板，以D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，α-鼠李糖，D-半乳糖，D-半乳糖醛酸為對照品，玉米須水提醇沉多糖粗品為樣品，用50％乙醇溶解，利用三氟乙酸進行水解，雙氧水進行脫色，以正丁醇、甲醇、氯仿、冰醋酸和水作為展開劑，以苯胺、二苯胺、磷酸和水溶液顯色。樣品與對照品的斑點位置和顏色一致，判斷所含糖的種類。此方法專屬性強，操作簡單，能夠準確鑒別玉米須多糖中單糖的種類。
文檔編號G01N30/90GK102608247SQ20121000811
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者侯迪超, 周鴻立, 張揚, 張艷, 黃啟 申請人:吉林化工學院