專利名稱：基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備及應用。具體是基于氨基化鈉基蒙脫石和納米多孔金膜構建的夾心型電化學免疫傳感器，用于測定多種腫瘤標志物，屬于功能材料和生物傳感技術領域。
背景技術：
腫瘤標志物在癌癥的早期診斷中具有重要的實用價值。腫瘤標志物是一種在腫瘤細胞的發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產生、或者由機體對腫瘤細胞的反應而產生的，反應腫瘤存在和生長的一類物質。包括蛋白質、激素、酶、多胺及癌基因產物等。腫瘤標志物在臨床中應用廣泛，在正常人群中的癌癥篩查、有癥狀者的癌癥輔助診斷、癌癥的臨床階段的分期、癌癥疾病進程的預后評估治療方案、判斷癌癥是否復發中起著極其重要的作用。目前臨床研究較多的腫瘤標志物有癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a-L-巖藻糖苷酶(AFU)、前列腺特異性抗原(PSA)、糖類抗原125 (CA-125)、糖類抗原15_3 (CA 15-3)、糖類抗原199(CA-199)、糖類抗原724(CA-724)、糖類抗原242 (CA-242)、人絨毛膜促性腺激素(盧-HCG)、甲狀腺球蛋白(TG)。檢測腫瘤標志物的方法主要有放射免疫測定法、酶免疫分析測定法、化學發光免疫分析等，這些檢測方法具有如下特點
(I)放射免疫測定法該法在生物醫學各個領域已得到廣泛的應用，其具有操作簡便、成本低等優點，但其放射性污染嚴重，靈敏度低，使其應用受到限制。(2)酶免疫分析測定法該法標記物制備簡單，有效期長，對環境無污染等特點，得到了迅速地普及和發展，但因酶容易失活，導致其信號時間短，降低了方法的靈敏度和重現性。(3)化學發光免疫分析測定法該法具有靈敏度高、選擇性強、重現性好、易于操作等優點，但其影響化學發光分析檢測結果的因素較多，穩定性較差，且在發生化學反應之后，樣品的發光無法再現。因此，發明一種檢測限低、靈敏度高、特異性強、重現性好的腫瘤標志物傳感器至
關重要。近年來，納米材料在單分子水平的各種探針技術、納米集成陣列器件、電極表面修飾等方面的研究取得了突飛猛進的發展參見(a) Lai G. S. ; Yan F. ; Wu J. ; Leng C.;Ju H. X. Anal. Chem., 2011，83，2726-2732. (b) Du D. ; Wang L. M. ; Shao Y. Y. ; WangJ. ; Engelhard M. H. ; Lin Y. H. Anal. Chem. , 2011，83，746-752.。氨基化鈉基蒙脫石是一種性能優越的納米材料，具有比表面積大、孔隙度高、生物相容性好、吸附性能好的特點，氨基化后可實現對一抗良好的結合能力，使之可固載和標記更多生物分子；此外其低廉的價格大大降低了傳感器的成本。納米多孔金膜具有比表面積大、導電性好的特點，加之其良好的生物相容性，可用于修飾電極以增大電極的有效面積，同時可直接固載抗體。本發明將以上氨基化鈉基蒙脫石和納米多孔金膜兩種納米材料用于電化學免疫傳感器的構建中，賦予電化學免疫傳感器更為突出的特色。首先采用納米多孔金膜固定一抗，由于納米多孔金膜具有三維連續開孔結構和大的比表面積，有利于固定更多的一抗，而且納米多孔金膜良好的生物相容性，可以與一抗直接結合，避免了交聯劑的使用；然后采用吸附硫堇后的氨基化鈉基蒙脫石標記二抗和辣根過氧化物酶，提高了其電極表面的電子傳遞效率，降低了檢測限、增加了傳感器的檢測靈敏度。按照以上方法制備的電化學免疫傳感器，利用鈉基蒙脫石具有較大的比表面積和孔隙度、良好的生物相容性，加之氨基化后可實現對一抗良好的結合能力，使之可固載更多抗體和酶。利用納米多孔金膜良好的三維連續開孔結構及生物相容性，可以直接固定大量腫瘤標志物一抗，同時具有良好的催化活性，能進一步提高電子傳遞效率等，進而顯著改善傳感器的靈敏度。經對現有腫瘤標志物檢測專利技術的檢索發現，目前CN200910212772. 0公開了 一種用于檢測甲胎蛋白的電化學發光免疫傳感器，該傳感器的檢測限達到0. 035 ng/mL，線性范圍為0.01 20 ng/mL。CN201110199112.0公開了一種檢測磷化蛋白的電化學免疫傳感器，其檢測限為0. 01 ng/mL，線性范圍為 0. 02 20 ng/mL。CN03113053. 4公開了一種檢測CA-125無試劑安培免疫傳感器。本發明分別采用納米多孔金膜和氨基化鈉基蒙脫石作為電極修飾和二抗標記材料，降低了傳感器的檢出限，對多種腫瘤標志物的檢測限在3.0 ^3.7 pg/mL之間。由此可以看出，其方法的靈敏度得到顯著提高，靈敏度均優于以上三種方法，可以準確定量檢測多種腫瘤標志物。本發明利用免疫反應的高特異性，結合納米多孔金膜和氨基化鈉基蒙脫石制備了一種夾心型電化學免疫傳感器并用來檢測多種腫瘤標志物。本發明具有靈敏度高、特異性好、檢測成本低、能快速檢測多種腫瘤標志物等優勢，且本發明制備過程簡單，操作過程簡便，有效克服了目前腫瘤標志物檢測方法的不足。

發明內容
本發明的技術任務之一是為了克服現有檢測腫瘤標志物技術中的不足，如儀器復雜、成本高、檢測過程繁瑣等缺點，提供一種高靈敏和特異性的電化學免疫傳感器的制備方法，其制備技術成熟可靠；
本發明的技術任務之二是提供該電化學免疫傳感器的應用，所述電化學免疫傳感器能高靈敏、特異性、低成本、快速檢測多種腫瘤標志物。 為了實現上述目的，本發明是通過以下措施來實現的。1.基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，其特征在于，包括以下步驟
(1)納米多孔金膜的制備；
(2)氨基化鈉基蒙脫石的制備；
(3)基于氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的制備；(4)腫瘤標志物傳感器的制備。(I)納米多孔金膜的制備
1)在25 35°C恒溫條件下，將金/銀重量比為1:1 1. 2的銀金合金薄膜漂浮在1(T15 mol L—1硝酸液面上4 7 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜；
2)將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7.O。(2)氨基化鈉基蒙脫石的制備
1)稱取10.00 g蒙脫石，放入大燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪拌2 3 h，置于平穩不受振動的實驗臺上，靜置；待分層后，取出上清液，即為蒙脫石懸浮液；將上述懸浮液加入到250 mL的0.50 mol !/1NaCl溶液中，攪拌12 24 h，靜置；分層后，吸出上清液；再加入250 mL的0.50 mol L^1NaCl溶液，攪拌12 h，靜置，吸出上清液；將蒙脫石懸浮液在離心機 上以8000 r HiirT1的速度離心12 min，倒掉上清液；重復操作，直至上清液中沒有Cl_為止；將洗滌后的試樣在烘箱中于70 80°C下干燥，干燥后的試樣研成粉末，過100目篩，得到提純鈉化后的蒙脫石；
2)將1.0g鈉基蒙脫石轉移到80 mL異丙醇和I mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加熱到80°C并持續2 h，使氨基修飾鈉基蒙脫石的表面，得到氨基化鈉基蒙脫石。(3)基于氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的制備
1)用PH7.0的PBS分散氨基化的鈉基蒙脫石(Na-Mont)，形成分散均勻的石墨烯懸浮
液；
2)將上述懸浮液與Img mr1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震蕩12 h后離心，棄去上清液，并將其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH ；
3)將Na-Mont-TH與戊二醛溶液混合，震蕩，再加入Img辣根過氧化物酶(HRP)和0. 01mg腫瘤標志物二抗(Ab2),振蕩反應6h后，離心，棄去上清液，并將其重新分散于ImL pH
7.0 的 PBS 中，得到 Na-Mont-TH-HRP-Ab2，將 Na-Mont-TH-HRP-Ab2 貯存于 4°C下。(4)腫瘤標志物傳感器的制備
1)在檢測前，將直徑4mm的玻碳電極依次用1. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，將電極置于5 mmol I/1鐵氰化鉀溶液中，在-0.2 0. 6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
2)用納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將6UL 10 Ug mL—1腫瘤標志物一抗(Ab1)滴涂到步驟2)室溫干燥的納米多孔金膜修飾的玻碳電極表面，保持濕潤0.5 1. 5 h，置于4°C濕潤條件下晾干，用pH 7.0的PBS緩沖溶液洗去未結合上的Ab1 ；
4)用3UL T2 wt%牛血清白蛋白(BSA)滴涂到步驟3)腫瘤標志物一抗修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，封閉非特異性活性位點，用pH 7.0的PBS緩沖溶液洗去未結合上的BSA ；
5)將6UL腫瘤標志物抗原滴涂在步驟4)得到的電極表面，保持濕潤孵育0.5 1. 5 h，4 °C下濕潤條件下晾干；
6)用6uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2滴涂在步驟5)得到的電極表面，保持濕潤0. 5 1. 5 h，4 °C下濕潤條件下晾干，用pH 7.0的PBS緩沖溶液洗去未結合上的Na-Mont-TH-HRP-Ab2,得到腫瘤標志物傳感器。
2.本發明所述的制備的腫瘤標志物傳感器，其特征在于，用于腫瘤標志物的檢測，包括以下步驟
(1)工作曲線的繪制；
(2)腫瘤標志物的檢測。(I)中所述的工作曲線的繪制，包括以下步驟
1)將所制備的腫瘤標志物傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統，結合電化學工作站CHI 760D，用循環伏安法以100 mVs—1在PBS溶液中進行掃描測定，選擇-0. 3 V為檢測電位，記錄響應電流Z0 ；
2)待背景電流穩定后，在PBS中加入1.0mmol L—1 H2O2，進行循環伏安掃描，記錄電流
Ii ;
3)根據上述步驟I)和步驟2)所得的電流差值AJ=I0-1i與腫瘤標志物抗原溶液濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。3.本發明所述的腫瘤標志物傳感器，其特征在于，所述的腫瘤標志物選自下列目前發病率高的腫瘤標志物之一癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a-L-巖藻糖苷酶(AFU)、前列腺特異性抗原(PSA)、糖類抗原125(CA-125)、糖類抗原15_3(CA 15_3)、糖類抗原199(CA-199)、糖類抗原724 (CA-724)、糖類抗原242 (CA-242)、人絨毛膜促性腺激素(J3 -HCG)、甲狀腺球蛋白(TG)。本發明的有益成果
與現有技術相比，本發明的的制備方法及應用，其突出的特點是
(1)將納米介孔材料和貴金屬納米材料引入到電化學免疫傳感器的制備中，有效的提高了電化學免疫傳感器的靈敏度和生物相容性；
(2)利用廉價、易得的鈉基蒙脫石，大大降低了免疫傳感器的成本。通過對鈉基蒙脫石進行氨基功能化，使其更有利于固定抗體和酶，同時保持其良好的生物活性；
(3)利用納米多孔金膜良好的三維連續開孔結構及生物相容性，可直接固定一抗；其良好的催化性能又顯著提高了傳感器的靈敏度；
(4)使用完全相同的材料和修飾方法，利用抗原與抗體的特異性結合，只需改變抗體種類即可實現多種腫瘤標志物的高靈敏、特異性檢測，此方法簡單、經濟，有利于促進傳感器的商品化。 ( 5 )本發明制備的電化學免疫傳感器用于腫瘤標志物的檢測，試劑用量少，檢測速度快，靈敏度高，特異性好，便于檢測。


圖1為鈉基蒙脫石的掃描電鏡圖。圖2為基于氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的制作過程。圖3為基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備過程。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例1
基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，包括以下步驟
(I)在30°C下，將金/銀質量比為1:1銀金合金薄膜漂浮在10 mol I/1硝酸液面上4 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜。將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7. O。(2)稱取10. 00 g蒙脫石，放入大燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪拌2 h，置于平穩不受振動的實驗臺上，靜置；待分層后，取出上清液，即為蒙脫石懸浮液；將上述懸浮液加入到250 mL的0.50 mol L^1NaCl溶液中，攪拌12 h，靜置；分層后，吸出上清液；再加入250mL的0.50 mol L^1NaCl溶液，攪拌12 h，靜置，吸出上清液；將蒙脫石懸浮液在離心機上以8000 r HiirT1的速度離心12 min，倒掉上清液；重復操作，直至上清液中沒有Cl_為止；將洗滌后的試樣在烘箱中于70°C下干燥，干燥后的試樣研成粉末，過100目篩，得到提純鈉化后的蒙脫石，即為鈉基蒙脫石。(3)將1. 0 g鈉基蒙脫石轉移到80 mL異丙醇和I mL 3_氨基丙基三乙氧基硅烷 的混合溶液中，加熱到80°C并持續2 h，使氨基修飾鈉基蒙脫石的表面，得到氨基化鈉基蒙脫石，該納米材料的形貌見圖1 ;由圖1可以就看出，氨基化鈉基蒙脫石呈現明顯的層狀結構，說明氨基化處理后并未改變蒙脫石的層狀結構。(4)用pH 7.0 PBS分散氨基化的鈉基蒙脫石(Na-Mont)，形成分散均勻的石墨烯懸浮液。將上述懸浮液與I mg mL—1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震蕩12 h后離心，棄去上清液，并將其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH。將Na-Mont-TH與戊二醛溶液混合、震蕩，再加入I mg辣根過氧化物酶(HRP)和0. 01 mg腫瘤標志物二抗(Ab2X振蕩反應6h后，離心，棄去上清液，并將其重新分散于ImL pH 7.0 PBS中，得到Na-Mont-TH-HRP-Ab2，貯存于4°C下，該氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的制備過程見圖2。(5)將直徑4 mm的玻碳電極依次用1. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在-0. 2 0. 6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV。(6)根據圖3基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備過程進行制備。將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥。將6 u L 10 UgmL1腫瘤標志物一抗滴涂到納米多孔金膜修飾的電極表面，保持濕潤I h，用pH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的Ab1置于4°C濕潤條件下晾干。將濃度為3 L I wt%牛血清白蛋白滴涂到腫瘤標志物一抗修飾的電極表面，用PH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的BSA，4°C下濕潤條件下晾干。將6 UL腫瘤標志物抗原滴涂在牛血清白蛋白修飾的電極表面，保持濕潤孵育0.5 h，4°C下濕潤條件下晾干。將步驟(3)制備的6 uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2腫瘤標志物二抗復合物溶液滴涂于腫瘤標志物抗原修飾的電極表面，保持濕潤0.5 h，用pH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的Ab1,4°C下濕潤條件下晾干。實施例2
基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，包括以下步驟
(I)在30°C下，將金/銀質量比為1:1.1銀金合金薄膜漂浮在12 mol I/1硝酸液面上5 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜。將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7. O。(2)稱取10. 00 g蒙脫石，放入大燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪拌2.5 h，置于平穩不受振動的實驗臺上，靜置；待分層后，取出上清液，即為蒙脫石懸浮液；將上述懸浮液加入到250 mL的O. 50 mo I T1NaCl溶液中，攪拌18 h，靜置；分層后，吸出上清液；再加入 250 mL的O. 50 mo I T1NaCl溶液，攪拌12 h，靜置，吸出上清液；將蒙脫石懸浮液在離心機上以8000 r HiirT1的速度離心12 min，倒掉上清液；重復操作，直至上清液中沒有Cl_為止； 將洗滌后的試樣在烘箱中于75°C下干燥，干燥后的試樣研成粉末，過100目篩，得到提純鈉化后的蒙脫石，即得到鈉基蒙脫石。
(3)將1. O g鈉基蒙脫石轉移到80 mL異丙醇和I mL 3_氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加熱到80°C并持續2 h，使氨基修飾鈉基蒙脫石的表面，得到氨基化鈉基蒙脫石。
(4)用pH 7.0 PBS分散氨基化的鈉基蒙脫石(Na-Mont)，形成分散均勻的石墨烯懸浮液。將上述懸浮液與I mg mL—1的硫堇溶液(TH)混合，37 °C下震蕩12 h后離心，棄去上清液，并將其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH。將Na-Mont-TH與戊二醛溶液混合、 震蕩，再加入I mg辣根過氧化物酶(HRP)和O. 01 mg腫瘤標志物二抗(Ab2)。振蕩反應6h 后，離心，棄去上清液，并將其重新分散于ImL pH 7.0 PBS中，得到Na-Mont-TH-HRP-Ab2，貯存于4°C下，該氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的過程見圖2?！?br> (5)將直徑4 mm的玻碳電極依次用1. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中， 在-0. 2 0. 6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV。
(6)根據圖3基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備過程進行制備。 將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥。將6 μ L 10 UgmL1腫瘤標志物一抗滴涂到納米多孔金膜修飾的電極表面，保持濕潤I h，用pH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的Ab1置于4°C濕潤條件下晾干。將濃度為3 UL 1.5 wt%牛血清白蛋白滴涂到腫瘤標志物一抗修飾的電極表面，用PH 7. O PBS緩沖溶液洗去未連接上的BSA，4°C下濕潤條件下晾干。將6 μ L腫瘤標志物抗原滴涂在牛血清白蛋白修飾的電極表面，保持濕潤孵育I h，4 °C下濕潤條件下晾干。將步驟(3)制備的6 μ L Na-Mont-TH-HRP-Ab2腫瘤標志物二抗復合物溶液滴涂于腫瘤標志物抗原修飾的電極表面，保持濕潤I h，用pH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的Ab1,4°C下濕潤條件下晾干。
實施例3基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，包括以下步驟(I)在35°C下，將金/銀重量比為1:1. 2銀金合金薄膜漂浮在15 mol I/1硝酸液面上7 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜。將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7. O。
(2)稱取10. 00 g蒙脫石，放入大燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪拌3 h，置于平穩不受振動的實驗臺上，靜置。待分層后，取出上清液，即為蒙脫石懸浮液。將上述懸浮液加入到250 mL的0.50 mol PNaCl溶液中，攪拌24 h，靜置。分層后，吸出上清液；再加入250 mL的0.50 mol PNaCl溶液，攪拌12 h，靜置，吸出上清液。將蒙脫石懸浮液在離心機上以 8000 r HiirT1的速度離心12 min，倒掉上清液。重復操作，直至上清液中沒有Cl_為止。將洗滌后的試樣在烘箱中于80°C下干燥，干燥后的試樣研成粉末，過100目篩，得到提純鈉化后的蒙脫石，即為鈉基蒙脫石。
(3)將l.Og鈉基蒙脫石轉移到80 mL異丙醇和I mL 3_氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加熱到80 °C并持續2 h，使氨基修飾鈉基蒙脫石的表面。
(4)用pH 7.0 PBS分散氨基化的鈉基蒙脫石(Na-Mont)，形成分散均勻的石墨烯懸浮液。將上述懸浮液與I mg mL—1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震蕩12 h后離心，棄去上清液，并將其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH。將Na-Mont-TH與戊二醛溶液混合、震蕩，再加入I mg辣根過氧化物酶(HRP)和0. 01 mg腫瘤標志物二抗(Ab2X振蕩反應6h后，離心，棄去上清液，并將其重新分散于ImL pH 7.0 PBS中，得到Na-Mont-TH-HRP-Ab2，貯存于4°C下，該氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的過程見圖2。(5)將直徑4 mm的玻碳電極依次用1. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在-0. 2 0. 6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV。(6)根據圖3基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備過程進行制備。將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥。將6 u L 10 UgmL1腫瘤標志物一抗滴涂到納米多孔金膜修飾的電極表面，保持濕潤1.5 h，用pH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的Ab1置于4°C濕潤條件下晾干，。將濃度為3 UL 2 七％牛血清白蛋白滴涂到腫瘤標志物一抗修飾的電極表面，用pH 7. 0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的BSA，4°C下濕潤條件下晾 干。將6 U L腫瘤標志物抗原滴涂在牛血清白蛋白修飾的電極表面，保持濕潤孵育1. 5 h，4°C下濕潤條件下晾干。將步驟(3)制備的6 uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2腫瘤標志物二抗復合物溶液滴涂于腫瘤標志物抗原修飾的電極表面，保持濕潤1. 5 h，用pH 7.0 PBS緩沖溶液洗去未連接上的Ab1,4°C下濕潤條件下晾干。實施例4
實施例1 3制備的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器，用于腫瘤標志物檢測，包括以下步驟
(1)工作曲線的繪制；
(2)腫瘤標志物的檢測；
(I)中所述工作曲線的繪制，包括以下步驟
1)將參比電極一飽和甘汞電極、對電極一鉬絲電極和工作電極正確連接在電化學工作站上，用循環伏安法以100 mV s—1在PBS溶液中進行掃描測定，選擇-0.3 V為檢測電位，記錄響應電流Z0 ；
2)待背景電流穩定后，在PBS中加入1.0mmol L—1 H2O2，進行循環伏安掃描，記錄電流
Ii ;
3)根據上述步驟I)和步驟2)所得的電流差值AJ=I0-1i與腫瘤標志物抗原溶液濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。實施例5乳腺癌腫瘤標志物檢測
一種乳腺癌腫瘤標志物傳感器的制備及應用，包括以下步驟
(1)選擇乳腺癌腫瘤標志物，聯合檢測CA-125、CA15-3、CEA和衫-HCG,按照實施例1所述的步驟構建電化學免疫傳感器；
(2)按照實施例4所述的步驟進行檢測，乳腺癌腫瘤標志物的檢測技術指標見表I。表I乳腺癌腫瘤標志物的檢測技術指標 表I乳腺癌腫瘤標志物的檢測技術指標
權利要求
1.基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備及應用，其特征在于，包括以下步驟 (1)納米多孔金膜的制備； (2)氨基化鈉基蒙脫石的制備； (3)基于氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的制備； (4)腫瘤標志物傳感器的制備。
2.根據權利要求1所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，所述納米多孔金膜的制備，其特征在于，包括以下步驟 (1)在25 35°C恒溫條件下，將金/銀質量比為1:1 1. 2的銀金合金薄膜漂浮在.10~15 mol I/1硝酸液面上4 7 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜； (2)將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7.0。
3.根據權利要求1所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，其特征在于，所述氨基化鈉基蒙脫石的制備，包括以下步驟 (1)稱取10.00 g蒙脫石，放入大燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪拌2 h，置于平穩不受振動的實驗臺上，靜置；待分層后，取出上清液，即為蒙脫石懸浮液；將上述懸浮液加入到250 mL的O. 50 mol !/1NaCl溶液中，攪拌12 24 h，靜置；分層后，吸出上清液；再加Λ250 mL的O. 50 mol T1NaCl溶液，攪拌12 h，靜置，吸出上清液；將蒙脫石懸浮液在離心機上以8000 r HiirT1的速度離心12 min，倒掉上清液；重復操作，直至上清液中沒有Cl_為止；將洗滌后的試樣在烘箱中于7(T80°C下干燥，干燥后的試樣研成粉末，過100目篩，得到提純鈉化后的蒙脫石； (2)將1.0g鈉基蒙脫石轉移到80 mL異丙醇和I mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，加熱到80°C并持續2 h，使氨基修飾鈉基蒙脫石的表面，得到氨基化鈉基蒙脫石。
4.根據權利要求1所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器的制備，其特征在于，所述基于氨基化鈉基蒙脫石標記的二抗的制備，包括以下步驟 (1)用pH7.0的PBS分散氨基化的鈉基蒙脫石(Na-Mont)，形成分散均勻的石墨烯懸浮液； (2)將上述懸浮液與Img πιΓ1的硫堇溶液(TH)混合，37°C下震蕩12 h后離心，棄去上清液，并將其重新分散于PBS中，得到Na-Mont-TH ； (3)將Na-Mont-TH與戊二醛溶液混合，震蕩，再加入Img辣根過氧化物酶(HRP)和O.01 mg腫瘤標志物二抗(Ab2),振蕩反應6h后，離心，棄去上清液，并將其重新分散于ImLpH 7. O 的 PBS 中，得到 Na-Mont-TH-HRP-Ab2，貯存于 4°C下。
5.根據權利要求1所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器，其特征在于，所述腫瘤標志物傳感器的制備，包括以下步驟 (1)在檢測前，將直徑4mm的玻碳電極依次用1. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面； (2)用納米多孔金膜修飾玻碳電極表面，室溫干燥； (3)將6μ L 10 μ g mL—1腫瘤標志物一抗(Ab1)滴涂到步驟(2)室溫干燥的納米多孔金膜修飾的玻碳電極表面，保持濕潤O. 5 1. 5 h，置于4°C濕潤條件下晾干，用pH 7.0的PBS緩沖溶液洗去未結合上的Ab1 ；(4)用3μ L 1^2 wt%牛血清白蛋白(BSA)滴涂到步驟(3)得到的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，封閉非特異性活性位點，用PH 7. O的PBS緩沖溶液洗去未結合上的BSA ； (5)將6μ L腫瘤標志物抗原滴涂在步驟(4)得到的電極表面，保持濕潤孵育O. 5^1. 5h，4°C下濕潤條件下晾干； (6)將6uL Na-Mont-TH-HRP-Ab2滴涂在步驟(5)得到的電極表面，保持濕潤0.5 1.5 h，4 °C下濕潤條件下晾干，用pH 7. O的PBS緩沖溶液洗去未結合上的Na-Mont-TH-HRP-Ab2，得到腫瘤標志物傳感器。
6.根據權利要求1-5所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器，其特征在于，所述腫瘤標志物傳感器用于檢測腫瘤標志物，包括以下步驟 (1)工作曲線的繪制； (2)腫瘤標志物的檢測。
7.根據權利要求6所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器，其特征在于，所述工作曲線的繪制，包括以下步驟 (1)將制備好的電極作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統，電化學工作站，采用循環伏安法以100 mV S—1在PBS溶液中進行掃描測定，選擇-O. 3 V為檢測電位，記錄響應電流I0 ； (2)待背景電流穩定后，在PBS中加入1.O mmol Γ1 H2O2，進行循環伏安掃描，記錄電流Ii ; (3)根據所述步驟(I)和步驟(2)所得的電流差值AJ=/,-Ji與腫瘤標志物抗原溶液濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。
8.根據權利要求1-7所述的基于氨基化鈉基蒙脫石的腫瘤標志物傳感器，其特征在于，所述腫瘤標志物選自下列目前發病率高的腫瘤標志物之一癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、a -L-巖藻糖苷酶(AFU)、前列腺特異性抗原(PSA)、糖類抗原125 (CA-125)、糖類抗原 15-3 (CA 15-3)、糖類抗原 199 (CA-199)、糖類抗原 724(CA_724)、糖類抗原 242(CA_242)、人絨毛膜促性腺激素(盧-HCG)、甲狀腺球蛋白TG。
全文摘要
本發明基于氨基化鈉基蒙脫石和納米多孔金膜構建的夾心型電化學免疫傳感器，屬于功能材料和生物傳感技術領域。本發明通過對鈉基蒙脫石進行氨基功能化，使其更有利于固定抗體和酶，同時保持其良好的生物活性；利用納米多孔金膜良好的三維連續開孔結構及生物相容性，可直接固定一抗，其良好的催化性能又顯著提高了傳感器的靈敏度；利用廉價、易得的鈉基蒙脫石，大大降低了傳感器的成本。本發明能實現多種腫瘤標記物的高靈敏、特異性、快速準確檢測。
文檔編號G01N27/26GK102998449SQ20121036179
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者魏琴, 杜斌, 辛曉東, 吳丹, 張勇, 李賀, 王志玲, 馬洪敏 申請人:濟南大學