專利名稱：上皮細胞粘附分子的核酸適體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸，特別涉及EpCAM(Epithelialcell adhesion molecule)上皮細胞粘附分子的核酸適體制備方法及其在腫瘤早期檢測、治療和預后中的應用。
背景技術：
EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)上皮細胞粘附分子屬于黏附分子家族，也稱為 17-A, ESA, EGP40, Trop-1, KSA, CD326, TACSTDI, C017-1A，GA733-2 等。EpCAM 是一種由腫瘤相關I丐信號轉導 I (tumor-associated calcium signal transducer1，TACSTD1)基因編碼的一個分子量30-40kDa的單次跨膜蛋白，參與調節細胞粘附、介導信號轉導、細胞遷移、增殖和分化等功能(I、Kurtz JE, Dufour P. Adecatumumab:ananti-EpCAM monoclonal antibody, from the bench to the bedside [ j] . ExpertOpin BioITher, 2010,10 (6) : 951-958 ；2> Trzpis M, McLaughlin PM, de Leij LM, et al.Epithelial cell adhesion molecule. More than a carcinoma marker and adhesion molecule [J]. Am J Pathol, 2007,171 (2):386-395)。EpCAM表達在人部分正常上皮細胞和大多數惡性上皮細胞表面，目前普遍認為它對腫瘤的生物學特性起重要作用。病理情況下，EpCAM幾乎表達于所有的腺癌中，包括結直腸腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝細胞癌和視網膜母細胞瘤(l、Kurtz JE,Dufour P. Adecatumumab:an anti-EpCAM monoclonal antibody,from thebench to the bedside[j]. Expert Opin BiolTher, 2010,10 (6) : 951-958)。研究發現EpCAM也是一些腫瘤干細胞的標記物，Kimura等的研究發現EpCAM陽性的肝癌干細胞能夠誘導免疫缺陷的小鼠發生腫瘤(3、Kimura O, Takahashi T, Ishii N, et al. Characterization oftheepithelial cell adhesion molecule (EpCAM)+cell population in hepatocellularcarcinoma cell lines[j]. Cancer Sci，2010，101 (10) : 2145-2155.)。將肝細胞癌 EpCAM陽性及陰性亞群細胞分別注射到免疫缺陷的小鼠體內，結果顯示形成腫瘤所需的癌細胞數EpCAM陽性者遠少于EpCAM陰性者，且注射EpCAM陽性癌細胞的小鼠所產生的腫瘤比注射EpCAM陰性者更大，說明EpCAM陽性的癌細胞致瘤性比EpCAM陰性的癌細胞大。肝細胞癌細胞系中EpCAM陽性的亞群克隆速率遠遠大于EpCAM陰性的亞群。研究還發現，EpCAM陽性的癌細胞可以分化為EpCAM陽性和陰性的細胞，而EpCAM陰性的癌細胞只能分化為EpCAM陰性的細胞，說明EpCAM陽性的癌細胞具有多項分化的潛能。腫瘤的復發、轉移是其死亡率居高不下的主要原因，循環血腫瘤細胞則是腫瘤復發、轉移的根源。及時發現循環血中腫瘤細胞，可以預防腫瘤復發和轉移，提高患者生存率，改善預后。EpCAM抗體與芯片技術結合用于分離腫瘤患者外周血中的腫瘤細胞，結果在99.1% (115 / 116)的血樣品中成功分離出數量不等的腫瘤細胞(其中包括所有7例早期前列腺癌患者)；而且循環血腫瘤細胞數的改變與影像學檢查的疾病進程高度關聯(4、NagratbS,Sequist LV,Mabeswaran S, et al. Isolation of rare circulating tumour cells incancer patients by microchip technology. Nature,2007,450(7173) :1235—1239)。但是，抗體由于分子量較大、位阻大、難儲存易降解等缺點，很大程度抑制了循環腫瘤細胞的檢測。EpCAM的表達與腫瘤的預后相關，可作為腫瘤靶向治療的一個靶位點。但是，目前由于EpCAM的免疫治療由于抗體特異性差、結合力低等原因，臨床試驗結果不甚理想。因此設計一種高親和力和高選擇性的識別上皮細胞黏附因子EpCAM的分子探針將會對腫瘤的早期診斷、治療和預后具有重要的意義。核酸適體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高特異性地和高親和力地與靶標分子結合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作用力形成特殊的三維結構，如發夾、假結、凸環、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質甚至影響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫學應用領域具有諸多優勢，如靶分子范圍廣、親和力與特異性強、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼 容性、無毒、體外穩定性好等。核酸適體可以通過配體指數富集系統進化技術(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選獲得，其基本原理是在體外人工化學合成一個寡核苷酸文庫，包括RNA、ssDNA或修飾的RNA和ssDNA，通過寡核苷酸文庫與目標分子的相互作用，結合PCR技術指數級放大與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過幾輪或數十輪篩選富集過程，獲得高親和力和高特異性的核酸適體。

發明內容
本發明的第一目的在于提供具有高特異性和高親和力的上皮細胞粘附分子的核酸適體。本發明的第二目的在于提供具有高特異性和高親和力的表達上皮細胞粘附分子的細胞核酸適體。本發明的第三目的在于提供上皮細胞粘附分子的核酸適體的制備方法。所述上皮細胞粘附分子EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)的核酸適體分別命名為 EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D 與 EpCAM Ccut，其序列如下EpCAMA agcgtcgaat accactacag tttggctctg ggggatgtgg aggggggtat gggtgggagt 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM B agcgtcgaat accactacag agctcggggt tttttggggt tttttggggt tttggtgggg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM C agcgtcgaat accactacag aggttgcgtc tgtcccacgt tgtcatgggg ggttggcctg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM D agcgtcgaat accactacag ctccggggtt tttgggggtt tttctggggt tttttggggc 60taatggagct cgtggtcag79EpCAM Ccut Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctgo
所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體及基于上述結構做切短、延長、部分堿基替換的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結構或者莖環結構。所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，包括以下步驟I)合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫；以Ni微珠為基質，篩選除去DNA隨機寡核苷酸庫中的非特異性結合部分，以上皮細胞粘附分子EpCAM微珠篩選得到與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸序列；2)將步驟I)所得與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸序列進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈酶親和素微珠為基質進行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫，形成次一級核酸文庫；3)將步驟2)所得的單鏈DNA文庫進行下一輪篩選，經過12輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶蛋白結合的 特異性和親和力。在步驟I)中，所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機序列，即為 5’-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-40nt_CTA ATG GAG CTC GTG GTCAG-3’，庫容量為IO15以上。 在步驟2)中，所述PCR擴增的引物為引物I :5，-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3，；引物2 :5，-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3，；所述PCR擴增產物為3’端帶有生物素標記、5’端帶有FAM標記的雙鏈DNA文庫。所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體作為與表達EpCAM蛋白的細胞系的核酸適配體。本發明所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法包括設計并合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫，篩選目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶蛋白結合的特異性和親和力。篩選獲得的核酸適體無毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標記，只特異性識別EpCAM蛋白，并且特異性識別表達EpCAM蛋白的細胞系，對不表達此蛋白的細胞系不具有識別功能。本發明的優點在于首先，通過真核表達的His標簽的識別上皮細胞黏附因子EpCAM的蛋白，進而通過Hid與Ni的親和反應把靶蛋白固定到微珠上，避免了傳統方法中通過共價反應偶聯到微珠上對蛋白質構象的影響，保證了蛋白的天然構象，保證篩選得到的核酸適配體可以識別膜上表達上皮細胞黏附因子EpCAM的蛋白。其次，微珠-流式細胞分析法相結合的篩選方法使得篩選與檢測更為簡便快速。而且，篩選獲得的核酸適體無毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標記。通過SELEX方法篩選獲得的核酸適體只特異性識別皮細胞粘附分子EpCAM，對其他同源蛋白不具有識別功能。上述優點使得所述核酸適體成為皮細胞粘附分子EpCAM檢測的有力工具，識別上皮細胞黏附因子EpCAM的核酸適配體在腫瘤的早期診斷、循環腫瘤細胞的捕獲、組織、活體成像和癌癥治療中具有重要的意義。


圖I為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA隨機寡核苷酸庫對上皮細胞黏附因子EpCAM的富集圖。在圖I中，橫坐標為熒光強度，縱坐標為微珠數，曲線A為初始DNA隨機寡核苷酸庫，曲線B為第5輪DNA隨機寡核苷酸庫，曲線C為第12輪DNA隨機寡核苷酸庫。圖2為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA隨機寡核苷酸庫對于Ni微珠的富集圖。在圖2中，橫坐標為熒光強度，縱坐標為微珠數，曲線A為初始DNA隨機寡核苷酸庫，曲線B為第5輪DNA隨機寡核苷酸庫，曲線C為第12輪DNA隨機寡核苷酸庫。圖3為流式細胞儀測定所得第12輪DNA隨機寡核苷酸庫對上皮細胞黏附因子EpCAM的解離常數。在圖3中，橫坐標為DNA濃度(nM)，縱坐標為平均熒光強度， 代表初始DNA隨機寡核苷酸庫，▽代表第12輪DNA隨機寡核苷酸庫。圖4為流式細胞儀測定所得核酸適體EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D對上皮細胞粘附分子EpCAM蛋白的偏移。在圖4中，橫坐標為熒光強度，縱坐標為微珠數。曲線a 為 Oth ；b 為 12th ；c 為 EpCAM A ;d 為 pCAM B ;e 為 pCAM C ;f■為 pCAM D。
圖5和6為流式細胞儀測定所得核酸適體EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D對各種細胞系的偏移。在圖5和6中,橫坐標為突光強度,縱坐標為微珠數；曲線a為RS ;b為 EpCAM A ;c 為 EpCAM B ;d 為 EpCAM C ;f 為 EpCAM D。圖7為流式細胞儀測定所得核酸適體EpCAM A對HEK-293T和MDA-MB-231細胞系的解離常數。在圖7中，橫坐標為DNA濃度(nmol/L)，縱坐標為平均熒光強度， 代表MDA-MB-231細胞系，〇代表HEK-293T細胞系。圖8為流式細胞儀測定所得核酸適體EpCAM C對HEK-293T和MDA-MB-231細胞系的解離常數。在圖8中，橫坐標為DNA濃度(nmol/L)，縱坐標為平均熒光強度，〇代表MDA-MB-231細胞系， 代表HEK-293T細胞系。圖9為通過圓二色譜法檢測所得EpCAM A、EpCAM B,EpCAM D核酸適體形成平行G四聚體結構。在圖9中，橫坐標為波長(nm),縱坐標為實測橢圓度(mdeg);曲線a為EpCAMA ；b 為 EpCAM B ;c 為 pCAM D。
具體實施例方式實施例I體外篩選與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸適體I)將合成好的5nmol單鏈DNA核酸庫溶于結合緩沖液(12mmol/L PBS,O. 55mmol/LMgCl2)中，進行熱處理95°C加熱5min，在冰上放置lOmin，然后室溫下放置IOmin ；2)將處理好的單鏈DNA核酸庫與Ni微珠進行孵育，收集未與Ni微珠結合的液體；3)將未與Ni微珠結合的液體與EpCAM Ni微珠一起于37°C下孵育40min ；4)使用結合緩沖液洗滌孵育后的EpCAM Ni微珠，再將結合了寡核苷酸的EpCAM Ni微珠做PCR反應；PCR 反應程序為94°C預變性 3min，94°C 30s, 53°C 30s, 68°C 30s，擴增 10 個循環,最后68°C終延伸5min,引物I :5，-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3，；引物2 :5，-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3，；5) PCR反應結束后，產物為3’端帶有生物素標記，5’端帶有FAM標記的雙鏈DNA，加入鏈酶親和素微珠，反應30min，然后用O. lmol/L NaOH進行單鏈化，經脫鹽柱純化即得到用于下一輪篩選的單鏈DNA文庫；
6)之后每輪使用200pmol的單鏈DNA文庫，并且逐步增加洗滌次數以增強篩選強度。共進行12輪篩選，而后通過流式細胞儀檢測單鏈DNA文庫的富集情況，結果顯示第12輪庫與靶蛋白EpCAM有比較明顯的結合(參見圖1)，而與Ni蛋白沒有結合(參見圖2)，最后把第12輪庫送去克隆測序。實施例2以流式分析法檢測所得單鏈DNA與上皮細胞粘附分子EpCAM的結合能力首先PCR擴增帶熒光標記的單鏈DNA，使用引物2 :5’ -Biotin-CTG ACC ACG AGCTCC ATT AG-3’ 與引物 3 :5，-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3’，PCR 產物為 5’端帶有FAM并且3’端帶有生物素的雙鏈DNA，加入鏈酶親和素微珠，反應30min，然后用0. Imol/LNaOH進行單鏈化，經脫鹽柱純化即得到用于流式分析的帶FAM標記的單鏈DNA。使用Onmol/L,5nmol/L,10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,lOOnmol/L,200nmol/L 濃度梯度的單鏈DNA與靶蛋白EpCAM Ni微珠來測定解離常數(Kd=22. 8±6. O)。用200 yl 結合緩沖液配置上述各濃度的DNA溶液，95°C加熱5min,冰上放置IOmin,然后室溫下放置IOmin0加入155nmol/L的EpCAM微珠，37°C下孵育40min。使用結合緩沖液洗滌微珠3次，而后把微珠重懸在250 u L結合緩沖液中。設置未經過篩選的初始DNA隨機寡核苷酸庫作對照。使用BD公司的FACSAria流式細胞儀對微珠進行熒光測定，而后用sigma plot軟件作圖，計算出所得核酸適體的解離常數(參見圖3、7和8)。實施例3篩選得到核酸適配體與各種細胞系特異結合I)將合成好的5nmol單鏈DNA核酸溶于結合緩沖液(12mmol/L PBS,0. 55mmol/LMgCl2)中，進行熱處理95°C加熱5min，在冰上放置lOmin，然后室溫下放置IOmin ；2)將處理好的單鏈DNA核酸與10000個細胞種于24孔板24h進行孵育，37°C下孵育30min或者4°C下孵育40min。3)孵育好后，去緩沖溶液洗兩次，再將細胞刮下來溶于200 u L緩沖溶液，使用BD公司的FACSAria流式細胞儀對微珠進行熒光測定(參見圖5和6)。實施例4以圓二色譜法測定所得核酸適體EpCAM A形成平行G四聚體結構用結合緩沖液配制I U mol/L核酸適體EpCAM A溶液,進行熱處理95°C加熱5min,冰上放置IOmin,然后室溫下放置lOmin。而后使用圓二色譜儀以0. Inm為步長掃描400nm到200nm的⑶光譜，重復掃描8次，結果分別在240nm與260nm處形成一個負峰和正峰，此峰型與文獻(5、Sattanathan Paramasivan, Iulian Rujan, Philip H. Bolton. Circulardichroism of quadruplex DNAs:Applications to structure,cation effects andligand binding, 2007, 43:324-331.)中報道的平行G四聚體的特征峰吻合，由此可判斷所獲得的核酸適體EpCAMA具有平行G四聚體結構(參見圖9)。
權利要求
1.上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，其特征在于所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體分別命名為EpCAM A、EpCAM B、EpCAM C、EpCAM D與EpCAM Ccut，其序列如下EpCAMA agcgtcgaat accactacag tttggctctg ggggatgtgg aggggggtat gggtgggagt 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM B agcgtcgaat accactacag agctcggggt tttttggggt tttttggggt tttggtgggg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAM C agcgtcgaat accactacag aggttgcgtc tgtcccacgt tgtcatgggg ggttggcctg 60ctaatggagc tcgtggtcag80EpCAMD agcgtcgaat accactacag ctccggggtt tttgggggtt tttctggggt tttttggggc 60taatggagct cgtggtcag79EpCAM Ccut Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctgο
2.如權利要求I所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，其特征在于所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體及基于上述結構做切短、延長、部分堿基替換的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體，所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結構或者莖環結構。
3.如權利要求I所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于包括以下步驟 O合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫；以Ni微珠為基質，篩選除去DNA隨機寡核苷酸庫中的非特異性結合部分，以上皮細胞粘附分子EpCAM微珠篩選得到與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸序列； 2)將步驟I)所得與上皮細胞粘附分子EpCAM特異結合的核酸序列進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈酶親和素微珠為基質進行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫，形成次一級核酸文庫； 3)將步驟2)所得的單鏈DNA文庫進行下一輪篩選，經過12輪篩選后獲得目的寡核苷酸序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶蛋白結合的特異性和親和力。
4.如權利要求3所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機序列，即為 5’-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-40nt_CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3’，庫容量為IO15以上。
5.如權利要求3所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述PCR擴增的引物為引物 I :5’-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3’ ；引物 2 :5，-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3，；所述PCR擴增產物為3’端帶有生物素標記、5’端帶有FAM標記的雙鏈DNA文庫。
6.如權利要求I所述的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體作為與表達EpCAM蛋白的細胞系的核酸適配體。
全文摘要
上皮細胞粘附分子的核酸適體及其制備方法，涉及一種核酸。提供具有高特異性和高親和力的上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體及其制備方法與應用。所述上皮細胞粘附分子EpCAM的核酸適體具有G四聚體結構或者莖環結構，制備方法包括設計并合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫，篩選目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶蛋白結合的特異性和親和力。篩選獲得的核酸適體無毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標記，只特異性識別EpCAM蛋白，并且特異性識別表達EpCAM蛋白的細胞系，對不表達此蛋白的細胞系不具有識別功能。
文檔編號G01N33/68GK102827845SQ201210362899
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者楊朝勇, 宋彥齡, 安源, 鄒遠, 張薇婷, 鄔杰, 莊峙廈 申請人:廈門大學