專利名稱：基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的dna測序裝置及制作方法
技術領域：
本發明涉及生物分子檢測技術領域，具體涉及一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置及制作方法。
背景技術：
DNA測序技術是現代生命科學研究的核心技術之一。在所有以低成本、高通量、直接測序為目標的第三代測序技術中，基于納米孔的單分子測序被認為是最有希望實現1000美元人類基因檢測計劃的技術。固態納米孔的孔徑可以靈活的人為控制，且具有理想的生化孔徑穩定性，優異的物、化性能。借助于顯微鏡電子束技術、聚焦離子束技術(FIB)等工藝，研究人員已經成功 制作出了各種孔徑可控的納米、亞納米固態孔。各種基于固態納米孔的DNA測序的研究也取得了很好的進展。然而，固態納米孔的制作也面臨一些問題。首先，采用FIB制作固態納米孔成本高且只能逐個制作；其次，固態納米孔通道長度通常為5nm以上，可以容納十多個堿基，這一尺寸對于測序所需要的分辨單個堿基引起的電流變化過長；再次，當單個核苷酸占據納米孔時只有大約100個離子穿過納米孔，而4個堿基在結構上只有數個原子的差異，這種細微的結構化差異導致的電流變化太微弱，以至于研究人員很難區分出每個堿基。第四，所有基于納米孔的測序方法目前尚無有效的控制DNA通過納米孔的流速的方法，由于速度太快，造成了堿基檢測識別率不高的問題。

發明內容
為解決上述技術問題，本發明的目的在于提出了一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置及制作方法，能夠改善傳統納米孔離子電流阻塞法信噪比低、易受外界環境干擾等問題，從而提高測序精度。為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置，包括SOI硅片I，置于SOI硅片I內的二氧化硅埋層2，在二氧化硅埋層2上部的SOI硅片I上刻蝕有倒金字塔形微腔21，在二氧化硅埋層2下部的SOI硅片I上刻蝕有直徑大于倒金字塔形微腔21塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔21的塔頂為固態納米孔20，二氧化硅薄膜5包覆在SOI硅片I外部，在柱狀孔底部的二氧化硅薄膜5外部包覆有金屬鉬薄膜6，在SOI硅片I上部有通過金電極12固定于二氧化硅薄膜5上的石墨烯8，在石墨烯8中央刻蝕有石墨烯納米孔19，石墨烯納米孔19和固態納米孔20同軸，在金電極12兩端的SOI硅片I外部上下采用聚二甲基硅氧烷10包圍形成空腔，空腔中填充有電解液18，置于SOI硅片I上部的鉬電極13接負電位，置于SOI硅片I下部的鉬電極13接正電位，鉬電極13和縱向微弱電流測量裝置15以及電源14構成縱向微弱電流測量回路，金電極12和橫向微弱電流測量裝置16以及電源22構成橫向微弱電流測量回路。所述二氧化硅埋層2的厚度為400nm。所述固態納米孔20的直徑為I. 5 10nm。所述石墨烯8為單原子層或多原子層。所述石墨烯納米孔19的直徑為I. 5 7nm。所述二氧化硅薄膜5厚度為5 30nm。
所述縱向微弱電流測量裝置15和橫向微弱電流測量裝置16均為皮安級電流表。所述電解液18為KCUNaCl或LiCl溶液，其濃度為O. 8 I. 5mol/L, pH值為8. O。所述電源14的偏置電壓為O. 05 O. 2V，硅片上方的鉬電極13接電源14負極，硅片下方鉬電極13接電源14正極。上述所述的DNA測序裝置的制作方法，包括如下步驟步驟I :在SOI硅片I的正面覆蓋一層300nm厚的保護材料鉻3，在SOI硅片I的背面覆蓋一層700nm厚的保護材料鋁4，所述SOI硅片I為P型SOI硅片；步驟2 :采用光刻技術將需要在SOI硅片I上刻蝕出的圖形加工到正面保護材料鉻3上和背面保護材料鋁4上，圖形的深度到達SOI硅片I的表面；步驟3 :以保護材料鋁4作為掩模，在SOI硅片I的背面運用感應耦合等離子體刻蝕的方法刻蝕出垂直的正方形柱狀孔，正方形刻蝕窗口的邊長為O. 8 I. 5mm，感應耦合等離子體刻蝕過程直到遇到SOI硅片I的二氧化硅埋層2時自停止；步驟4 以保護材料鉻3作為掩模，在SOI硅片I的正面采用KOH溶液各向異性濕法刻蝕的方法刻蝕出倒錐形的腔，根據SOI硅片I頂層硅的厚度H來設計KOH溶液各向異性濕法刻蝕窗口正方形的邊長W，其關系式為W = 2H/tana，其中a是單晶硅(100)晶面與(111)晶面之間的夾角，為54. 74°，KOH溶液配比為KOH=H2O :IPA=50g :100mL :10mL，其中IPA為異丙醇，刻蝕溫度為60°C，精度控制在±1°C ;步驟5 :使用氫氟酸溶液除去SOI硅片I的氧化埋層2，釋放納米孔，得到直徑為10 30nm的固態納米孔20 ；步驟6 :使用硝酸鈰銨溶液除去SOI硅片I正面的保護材料鉻3，使用磷酸溶液除去SOI硅片I背面的保護材料鋁4 ；步驟7 :將制作有固態納米孔20的SOI硅片I表面熱氧化生長一層厚度為5 30nm的致密的二氧化娃薄膜5,此步驟既能夠使固態納米孔20直徑收縮至I. 5 IOnm,又能夠保證SOI硅片I與下一步中的石墨烯8保持良好的絕緣；步驟8 :在硅襯底背面感應耦合等離子體刻蝕區域濺射一層厚度為200 400nm的金屬鉬薄膜6，以此作為離子刻蝕石墨烯8形成石墨烯納米孔19的掩模；步驟9 :采用CVD方法在銅基9上面制備的石墨烯8轉移到SOI硅片I表面首先以銅基9為基底通過CVD生長制備石墨稀8,并在石墨稀8表面旋涂聚甲基丙稀酸甲酷7 ；然后使用聚二甲基硅氧烷10自然粘合在聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/銅基表面；接下來先把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/銅基置于FeCl3溶液11中腐蝕掉銅基9，并多次在去離子水中清洗，去除石墨烯8表面殘存的金屬離子；然后利用聚二甲基硅氧烷10把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯轉移到準備好的SOI硅片I上；再去除聚甲基丙烯酸甲酯7和聚二甲基硅氧烷10。
步驟10 :在石墨烯8兩端淀積金電極12，以此可將石墨烯固定在SOI硅片I上。步驟11 :以金屬鉬薄膜6為掩模，運用離子自對準刻蝕在微尺寸石墨烯8上制備直徑為I. 5 7nm的石墨烯納米孔19。步驟12 :在兩個金電極12之間接入橫向微弱電流測量裝置16和電源22，在兩個鉬電極13之間接入縱向微弱電流測量裝置15和提供驅動單鏈DNA17穿過石墨烯納米孔19和固態納米孔20電場的電源14，最后制得基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測
序裝置。本發明和現有技術相比，具有如下優點I)、一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔(GPCP)結構的新型DNA測序裝置，即利用傳統的硅材料及新材料石墨烯設計一種新型石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔(GPCP)的結構。固態納米孔克服了生物分子納米孔的不穩定性和孔徑不易控制性；石墨烯 納米孔的采用解決了常規固態納米孔通道太長導致測序分辨率難以達到單個堿基的問題。此外，這種結構還在一定程度上實現了對核酸分子穿越納米孔的速度控制，為檢測贏得了時間；這些為實現單堿基分辨率、直接納米孔測序奠定了基礎。同時利用納米孔縱向離子電流和石墨烯橫向電導率變化的雙數據解析測序新思想。采用這種雙向數據解析測序可以提供核酸分子穿越石墨烯納米孔-腔-孔結構時更多的信息，有望改善傳統納米孔離子電流阻塞法信噪比低、易受外界環境干擾等問題，從而提高測序精度，有望從根本上解決目前新一代DNA測序所面臨的問題。2)、由于本發明采用KOH溶液各向異性濕法刻蝕與感應耦合等離子體干法刻蝕相結合的方法，在SOI硅片上制作固態納米孔，并結合石墨烯納米孔構成石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的GPCP結構，通過施加電場使得帶負電荷的核酸分子穿過GPCP結構，該結構不但可以控制DNA通過孔的速度，同時由于采用了石墨烯材料，可以進行縱向離子電流和橫向電流檢測，實現雙數據解析精確測算核酸序列，有望從根本上解決目前新一代DNA測序所面臨的問題。


圖I為本發明基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置的示意圖。圖2為本發明中制作固態納米孔的流程圖。圖3為本發明制備石墨烯的流程圖。圖4為本發明將制備的石墨烯轉移到SOI硅片上的流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明進行詳細說明。如圖I所示，本發明一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置，包括SOI硅片1，置于SOI硅片I內的二氧化硅埋層2，在二氧化硅埋層2上部的SOI硅片I上刻蝕有倒金字塔形微腔21，在二氧化硅埋層2下部的SOI硅片I上刻蝕有直徑大于倒金字塔形微腔21塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔21的塔頂為固態納米孔20，二氧化硅薄膜5包覆在SOI硅片I外部，在柱狀孔底部的二氧化硅薄膜5外部包覆有金屬鉬薄膜6，在SOI硅片I上部有通過金電極12固定于二氧化硅薄膜5上的石墨烯8，在石墨烯8中央刻蝕有石墨烯納米孔19，石墨烯納米孔19和固態納米孔20同軸，在金電極12兩端的SOI硅片I外部上下采用聚二甲基硅氧烷10包圍形成空腔，空腔中填充有電解液18，置于SOI硅片I上部的鉬電極13接負電位，置于SOI硅片I下部的鉬電極13接正電位，鉬電極13和縱向微弱電流測量裝置15以及電源14構 成縱向微弱電流測量回路，金電極12和橫向微弱電流測量裝置16以及電源22構成橫向微弱電流測量回路。優選二氧化硅埋層2的厚度為400nm。
優選固態納米孔20的直徑為I. 5 10nm。優選石墨烯8為單原子層或多原子層。優選石墨烯納米孔19的直徑為I. 5 7nm。優選二氧化硅薄膜5厚度為5 30nm。優選縱向微弱電流測量裝置15和橫向微弱電流測量裝置16均為皮安級電流表。優選電解液18為KCl、NaCl或LiCl溶液，其濃度為O. 8 I. 5mol/L, pH值為8. O。優選電源14的偏置電壓為O. 05 O. 2V，硅片上方的鉬電極13接電源14負極，硅片下方鉬電極13接電源14正極。本發明還提供了一種基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置的制作方法，如圖2、圖3和圖4所示，包括以下步驟步驟I :在SOI硅片I的正面覆蓋一層300nm厚的保護材料鉻3，在SOI硅片I的背面覆蓋一層700nm厚的保護材料鋁4，保護材料鉻3和保護材料鋁4均采用磁控濺射的方法生成，所述SOI硅片I為P型SOI硅片；步驟2 :采用光刻技術將需要在SOI硅片I上刻蝕出的圖形加工到正面保護材料鉻3上和背面保護材料鋁4上，圖形的深度到達SOI硅片I的表面；步驟3 以保護材料鋁4作為掩模，在SOI硅片I的背面運用感應耦合等離子體刻蝕的方法刻蝕出垂直的正方形柱狀孔，正方形刻蝕窗口的邊長為O. 8 I. 5mm，感應耦合等離子體刻蝕過程直到遇到SOI硅片I的二氧化硅埋層2時自停止；步驟4 以保護材料鉻3作為掩模，在SOI硅片I的正面采用KOH溶液各向異性濕法刻蝕的方法刻蝕出倒錐形的腔，根據SOI硅片I頂層硅的厚度H來設計KOH溶液各向異性濕法刻蝕窗口正方形的邊長W，其關系式為W=2H/tana，其中a是單晶硅(100)晶面與
(111)晶面之間的夾角，約為54. 74°，1(0!1溶液配比為1(0!1:!120:1 六=5(^:1001^:101^，其中IPA為異丙醇，刻蝕溫度為60°C，精度控制在±1°C ；步驟5 :使用氫氟酸溶液除去SOI硅片I的氧化埋層2，釋放納米孔，得到直徑為10 30nm的固態納米孔20 ；步驟6 :使用硝酸鈰銨溶液除去SOI硅片I正面的保護材料鉻3，使用磷酸溶液除去SOI硅片I背面的保護材料鋁4 ；步驟7 :將制作有固態納米孔20的SOI硅片I表面熱氧化生長一層厚度為5 30nm的致密的二氧化娃薄膜5,此步驟既能夠使固態納米孔20直徑收縮至I. 5 IOnm,又能夠保證SOI硅片I與下一步中的石墨烯8保持良好的絕緣；步驟8 :在硅襯底背面感應耦合等離子體刻蝕區域濺射一層厚度為200 400nm的金屬鉬薄膜6，以此作為離子刻蝕石墨烯8形成石墨烯納米孔19的掩模；步驟9 :把以銅基9CVD方法制備的石墨烯8轉移到SOI硅片I表面首先以銅基9為基底通過CVD生長制備石墨烯8，并在石墨烯8表面旋涂聚甲基丙烯酸甲酯7 ;然后使用聚二甲基硅氧烷10自然粘合在聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/銅基表面；接下來先把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/銅基置于FeCl3溶液11中腐蝕掉銅基9，并多次在去離子水中清洗，去除石墨烯8表面殘存的金屬離子；然后利用聚二甲基硅氧烷10把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯轉移到準備好的SOI硅片I上；再去除聚甲基丙烯酸甲酯7和聚二甲基硅氧烷10 ；步驟10 :在石墨烯8兩端淀積金電極12，以此可將石墨烯固定在SOI硅片I上。步驟11 :以金屬鉬薄膜6為掩模，運用離子自對準刻蝕在微尺寸石墨烯8上制備直徑為I. 5 7nm的石墨烯納米孔19。步驟12 :在兩個金電極12之間接入橫向微弱電流測量裝置16和電源22，在兩個鉬電極13之間接入縱向微弱電流測量裝置15和提供驅動單鏈DNA17穿過石墨烯納米孔19和固態納米孔20電場的電源14，最后制得基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測 序裝置。
權利要求
1.基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置，其特征在于包括SOI硅片(I),置于SOI硅片(I)內的二氧化硅埋層(2)，在二氧化硅埋層(2)上部的SOI硅片(I)上刻蝕有倒金字塔形微腔(21)，在二氧化硅埋層(2)下部的SOI硅片(I)上刻蝕有直徑大于倒金字塔形微腔(21)塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔(21)的塔頂為固態納米孔(20)，二氧化硅薄膜(5)包覆在SOI硅片(I)外部，在柱狀孔底部的二氧化硅薄膜(5)外部包覆有金屬鉬薄膜(6),在SOI娃片(I)上部有通過金電極(12)固定于二氧化娃薄膜(5)上的石墨稀(8),在石墨稀(8)中央刻蝕有石墨稀納米孔(19),石墨稀納米孔(19)和固態納米孔(20)同軸，在金電極(12)兩端的SOI硅片(I)外部上下采用聚二甲基硅氧烷(10)包圍形成空腔，空腔中填充有電解液(18)，置于SOI硅片(I)上部的鉬電極(13)接負電位，置于SOI硅片(I)下部的鉬電極(13)接正電位，鉬電極(13)和縱向微弱電流測量裝置(15)以及電源(14)構成縱向微弱電流測量回路，金電極(12)和橫向微弱電流測量裝置(16)以及電源(22)構成橫向微弱電流測量回路。
2.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述二氧化硅埋層(2)的厚度為400nmo
3.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述固態納米孔(20)的直徑為L 5 IOnm0
4.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述石墨烯(8)為單原子層或多原子層。
5.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述石墨烯納米孔(19)的直徑為L 5 7nm。
6.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述二氧化硅薄膜(5)厚度為5 30nmo
7.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述縱向微弱電流測量裝置(15)和橫向微弱電流測量裝置(16)均為皮安級電流表。
8.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述電解液(18)為KCl、NaCl或LiCl溶液，其濃度為O. 8 I. 5mol/L, pH值為8. O。
9.根據權利要求I所述的DNA測序裝置，其特征在于所述電源(14)的偏置電壓為O.05 O. 2V，硅片上方的鉬電極(13)接電源(14)負極，硅片下方鉬電極(13)接電源(14)正極。
10.權利要求I至9任一項所述的DNA測序裝置的制作方法，其特征在于包括如下步驟 步驟I :在SOI硅片(I)的正面覆蓋一層300nm厚的保護材料鉻(3)，在SOI硅片(I)的背面覆蓋一層700nm厚的保護材料鋁(4)，所述SOI硅片(I)為P型SOI硅片； 步驟2 :采用光刻技術將需要在SOI硅片(I)上刻蝕出的圖形加工到正面保護材料鉻(3)上和背面保護材料鋁(4)上，圖形的深度到達SOI硅片(I)的表面； 步驟3 :以保護材料鋁(4)作為掩模，在SOI硅片(I)的背面運用感應耦合等離子體刻蝕的方法刻蝕出垂直的正方形柱狀孔，正方形刻蝕窗口的邊長為O. 8 I. 5mm，感應耦合等離子體刻蝕過程直到遇到SOI硅片(I)的二氧化硅埋層(2)時自停止； 步驟4 以保護材料鉻(3)作為掩模，在SOI硅片(I)的正面采用KOH溶液各向異性濕法刻蝕的方法刻蝕出倒錐形的腔，根據SOI硅片(I)頂層硅的厚度H來設計KOH溶液各向異性濕法刻蝕窗口正方形的邊長W，其關系式為W = 2H/tana，其中a是單晶硅100晶面與111晶面之間的夾角，為54. 74°，KOH溶液配比為K0H:H20:IPA=50g:100mL:10mL，其中IPA為異丙醇，刻蝕溫度為60°C，精度控制在±1°C ; 步驟5 :使用氫氟酸溶液除去SOI硅片(I)的氧化埋層(2)，釋放納米孔，得到直徑為10 30nm的固態納米孔(20)； 步驟6 :使用硝酸鈰銨溶液除去SOI硅片(I)正面的保護材料鉻(3)，使用磷酸溶液除去SOI硅片(I)背面的保護材料鋁(4)； 步驟7 :將制作有固態納米孔(20)的SOI硅片(I)表面熱氧化生長一層厚度為5 30nm的致密的二氧化硅薄膜(5)，此步驟既能夠使固態納米孔(20)直徑收縮至I. 5 10nm，又能夠保證SOI硅片(I)與下一步中的石墨烯(8)保持良好的絕緣； 步驟8 :在硅襯底背面感應耦合等離子體刻蝕區域濺射一層厚度為200 400nm的金屬鉬薄膜(6)，以此作為離子刻蝕石墨烯(8)形成石墨烯納米孔(19)的掩模； 步驟9 :把以銅基(9)CVD方法制備的石墨烯(8)轉移到SOI硅片(I)表面首先以銅基(9)為基底通過CVD生長制備石墨烯(8)，并在石墨烯(8)表面旋涂聚甲基丙烯酸甲酯(7);然后使用聚二甲基硅氧烷(10)自然粘合在聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/銅基表面；接下來先把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/銅基置于FeC13溶液(11)中腐蝕掉銅基(9)，并多次在去離子水中清洗，去除石墨烯(8)表面殘存的金屬離子；然后利用聚二甲基硅氧烷(10)把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯轉移到準備好的SOI硅片(I)上；再去除聚甲基丙烯酸甲酯(7)和聚二甲基硅氧烷(10)； 步驟10 :在石墨烯(8)兩端淀積金電極(12)，以此可將石墨烯固定在SOI硅片(I)上。步驟11 :以金屬鉬薄膜(6)為掩模，運用離子自對準刻蝕在微尺寸石墨烯(8)上制備直徑為I. 5 7nm的石墨烯納米孔(19)。
步驟12 :在兩個金電極(12)之間接入橫向微弱電流測量裝置(16)和電源(22)，在兩個鉬電極(13)之間接入縱向微弱電流測量裝置(15)和提供驅動單鏈DNA (17)穿過石墨烯納米孔(19)和固態納米孔(20)電場的電源(14)，最后制得基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置。
全文摘要
基于石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔的DNA測序裝置及制作方法，在SOI硅片上部刻蝕有倒金字塔形微腔，在其下部刻蝕有柱狀孔，倒金字塔形微腔塔頂為固態納米孔，在上部有石墨烯，在石墨烯中央刻蝕有石墨烯納米孔，鉑電極和縱向微弱電流測量裝置及電源構成縱向微弱電流測量回路，金電極和橫向微弱電流測量裝置及電源構成橫向微弱電流測量回路；在SOI硅片正面刻蝕倒錐形腔，背面刻蝕垂直柱狀孔，腐蝕掉其上氧化埋層，形成固態納米孔，將已經制備的石墨烯轉移到SOI硅片表面，在石墨烯中央刻蝕出與固定納米孔同軸的石墨烯納米孔；將芯片、電源和電流表組成電路，通過測定DNA穿過納米孔時電路中電流強度的變化，實現對DNA的測序。
文檔編號G01N27/416GK102901763SQ20121036273
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者劉澤文, 鄧濤, 陳劍 申請人:清華大學