專利名稱：一種制備酶與底物復合物晶體的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備酶與底物復合物晶體的方法。
背景技術：
準確地把握生物大分子及其復合物的結構是了解生命過程的基礎，對其三維結構的解析，可給出大量的其本身及所屬體系的信息。利用生物大分子X射線衍射系統測定生物大分子及其復合物晶體結構的方法，是目前結構生物學研究領域的主要手段。該工作可大致分成以下四個環節高純度大分子樣品的制備；晶體的獲得；結構的解析；結構信息指導下的生物學研究。在目前的技術條件下，樣品晶體的質量是影響其結構解析的主要原因。影響生物大分子晶體及其復合物質量的主要原因是分子的化學穩定性及構象一致性較差而得不到穩定的復合物晶體。例如，在通常條件下，當酶與底物發生反應時，底物會被酶降解，所以不易清楚地看到底物和酶的結合情況。突變酶中關鍵基團使酶失活以及選用底物類似物替代原有底物的的方法，經常被用來捕捉酶和底物的結合，但由此方法獲得的結構多為近似結構。另外，在常溫下，酶與底物的結合一般不很穩定，這樣底物即便在失活酶中的位置也經常不易確定。另外，一些低溫技術也被用于提高衍射數據的質量，例如由常溫迅速降溫到_180°C的“閃淬”技術；將已凍晶體回浸到晶體母液中再次冷凍的方法。突變酶中關鍵基團以及選用底物類似物的方法，缺陷在于獲得的結構為近似結構，而低溫技術只是用來提高衍射分辨率，沒有涉及到抑制酶活。因此，對晶體處理方法的改進對于提高解析結構的質量有著非常重要的意義。

發明內容
為解決上述技術問題，本發明目的是提供一種制備酶與底物復合物晶體的方法，用于分析復合物晶體的結構。我們發現在低溫_20°C條件下，分子構象的一致性、分子間結合的穩定性都會大大改善，一般酶的生物活性也會大幅度降低。由此獲得的酶-底物復合物更為穩定，得到的晶體結構衍射數據更趨于復合物結合時的實際結構。基于上述考慮，提出了“酶晶體低溫抑活底物固定”方法。本發明所述方法是將酶與底物置于_20°C低溫結合，包括以下步驟1)將酶蛋白晶體放入防凍液中，置于_20°C中，5-10分鐘；2)迅速取出酶蛋白晶體，加入與防凍液等體積的底物；3)將酶蛋白晶體與底物復合物再次置于_20°C中，5-10分鐘；4)取出后迅速放入液氮中固定。其中，所述酶蛋白晶體為6-磷酸-β_葡萄糖苷酶；所述底物為對硝基苯-β -D-吡喃匍萄糖昔-6-憐酸。
所述對硝基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸的濃度為20mM。所述防凍液為50%甘油和池液，體積比為1:2。所述池液為O. 1M4-羥乙基哌嗪乙石黃酸鈉(HEPES sodium) pH 7. 5、10% 異丙醇和 20% 聚乙二醇 4000 (Polyethylene glycol4000)。在本發明的優選的實施例中，所述方法包括以下步驟I)準備低溫晶體板；2)制備防凍液；3)將蛋白晶體6-磷酸-β -葡萄糖苷酶放入防凍液中，置于晶體板上，置于_20°C，10分鐘；4)取出蛋白晶體板，加入3 μ I 20mM對硝基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷_6_磷酸；5)將晶體板放回-20°C中，10分鐘。6)取出晶體板，將蛋白晶體與底物復合物放入液氮固定。采用以下方法準備低溫晶體板用水將含有甘油的紙條潤濕，再將坐滴孔內加滿水，蓋上玻璃蓋。所述防凍液為I μ I 50% (ν/ν)甘油和2μ I池液；其中，所述池液為O.1M 4_輕乙基哌嗪乙磺酸鈉，pH 7. 5、10% (ν/ν)異丙醇和20%聚乙二醇4000 (w/v)。

本發明進一步通過X光衍射儀收集復合物晶體數據。本方法原理是利用低溫條件使酶活性降低，使底物與酶的結合更穩定，在此條件下無需改變酶與底物而得到復合物晶體，再利用液氮固定晶體，最終獲得酶-底物復合物的實際結構。具體地，在-20°C環境溫度下浸泡底物，此時酶基本失去活性、底物不易降解而底物和酶結合的穩定性卻大大提高，平衡后將晶體迅速沉入液氮便可得到理想的酶-底物復合物。本發明的有益效果為(I)本方法將酶晶體和底物置于使酶失活的低溫條件下，進行底物浸泡，首先，可以獲得真實的酶-底物復合物結構；其次，可進一步提聞底物的占有率和空間穩定性，以提高底物電子密度的質量。另外，在提高生物大分子及復合物晶體的空間有序性基礎上，可獲得更高分辨率的衍射數據。(2)本方法是對生物大分子X射線晶體衍射系統樣品處理方法的技術開發和改進。通過此技術，可以獲得復合物結合狀態的真實結構并提高衍射數據的質量，進一步提高X射線生物大分子晶體學研究的水平，以及X射線晶體衍射系統的檢測水平，擴大其應用范圍。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例11、準備低溫晶體板，用水將含有甘油的紙條潤濕，再將坐滴孔內加滿水，蓋上玻璃蓋，保持環境的濕度。
2、制備防凍液1μ I 50%(ν/ν)甘油，2 μ I池液(O.1M 4_羥乙基哌嗪乙磺酸鈉，pH
7.5、10% (ν/ν)異丙醇和 20% 聚乙二醇 4000 (w/v))3、用尼龍環挑出6-磷酸-β_葡萄糖苷酶蛋白晶體，放入防凍液中，迅速置于_20°C低溫冰箱中，等待10分鐘。4、迅速取出蛋白晶體板，快速加入3 μ I 20mM底物對硝基苯-β _D_吡喃葡萄糖苷-6-磷酸。5、再次將晶體板放回-20°C低溫冰箱中，等待10分鐘。6、再次迅速取出晶體板，用尼龍環挑出蛋白晶體與底物復合物，放入液氮固定。對照組制備方法同實施例1，不同之處在于步驟3和4中置于4°C層析室。由結果可知，對于本發明的技術方案，在低溫下酶失活，通過X光衍射儀收集復合物晶體數據，分辨率2A。對于酶的反應底物對硝基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸，在復合物晶體結構中有較完整的電子密度。而對照組為常規方法浸泡，底物大都被降解，苯環部分密度很低。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的 基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種制備酶與底物復合物晶體的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將酶蛋白晶體放入防凍液中，置于-20°C中，5-10分鐘； 2)迅速取出酶蛋白晶體，加入與防凍液等體積的底物； 3)將酶蛋白晶體與底物復合物再次置于_20°C中，5-10分鐘； 4)取出后迅速放入液氮中固定。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶蛋白晶體為6-磷酸-β-葡萄糖苷酶。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物為對硝基苯-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述對硝基苯-β-D-批喃葡萄糖苷-6-磷酸的濃度為20mM。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述防凍液為50%甘油和池液，體積比為1:2。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述池液為O.1M4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉pH 7. 5、10%異丙醇和20%聚乙二醇4000。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，進一步通過X光衍射儀收集復合物晶體數據。
全文摘要
本發明涉及一種制備酶與底物復合物晶體的方法。具體步驟為1)將酶蛋白晶體放入防凍液中，置于-20℃中，5-10分鐘；2)迅速取出酶蛋白晶體，加入與防凍液等體積的底物；3)將酶蛋白晶體與底物復合物再次置于-20℃中，5-10分鐘；4)取出后迅速放入液氮中固定。本發明可以獲得真實的酶-底物復合物結構；可進一步提高底物的占有率和空間穩定性，以提高底物電子密度的質量。在提高生物大分子及復合物晶體的空間有序性基礎上，可獲得更高分辨率的衍射數據。
文檔編號G01N1/28GK103063487SQ20121055668
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者李宏濱, 劉一葦 申請人:中國科學院微生物研究所