一種快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]病原物是能夠引起植物或者動物病害的生命體的統(tǒng)稱。但是，目前對于病原生物的診斷方法單一、效率低、特異性較差。所以，建立病原生物尤其是新變異的病原物的特異性檢測靶標(biāo)的篩選是快速、高效實(shí)現(xiàn)病原物的診斷和防治的基礎(chǔ)。
[0003]對于家蠶微粒子病的檢測可以追溯到1870年，巴斯德創(chuàng)立了母蛾鏡檢法檢測家蠶微孢子，100多年來，此方法一直沿用至今，是生產(chǎn)上用于檢測的傳統(tǒng)方法。但是該方法較為復(fù)雜、對于操作者經(jīng)驗(yàn)要求較強(qiáng)，并且不同人操作存在誤差較大。因此，目前對于該病的檢測研究熱點(diǎn)主要集中在尋找一種更簡單、更快速的檢測方法。到目前為止家蠶微孢子蟲的檢測經(jīng)歷了以下幾個階段:顯微鏡檢、分子生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測。近年來，逐步還發(fā)展了其針對微孢子蟲種間孢壁蛋白抗原性的不同而開展的一系列免疫學(xué)檢測方法。但是，由于免疫學(xué)檢測方法的確立試驗(yàn)周期較長、經(jīng)濟(jì)成本較大，因此，在一定程度上制約了該法的推廣應(yīng)用。不過，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，2004年家蠶微孢子蟲全基因組測序完成，并繪制了框架圖，微粒子病的檢測開始進(jìn)入了分子生物學(xué)階段，利用PCR技術(shù)或LAMP技術(shù)檢測微粒子病的方法始見報道。盡快PCR檢測試劑盒存在研究周期較短、投入成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，但是，由于現(xiàn)有技術(shù)中沒有一種統(tǒng)一的靶基因確定辦法，因此，目前市場上現(xiàn)存的PCR檢測試劑盒存在靈敏度、特異性較差的問題。那么，盡快建立一種特異性較好、針對性較強(qiáng)的靶基因檢索方法就成為微粒子病檢測工作的重中之重。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是為解決目前對于病原生物的診斷方法單一、效率低、特異性較差的難題，提供一種快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法。
[0005]本發(fā)明提供一種快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法，包括以下步驟:
[0006]采集新型病原生物的樣本，提取其基因組，構(gòu)建基因組文庫；
[0007]通過NCBI的已發(fā)布的基因組信息，基于看家基因座位的保守性，進(jìn)行染色體或者scaffold逐一對齊，同時進(jìn)行共線性分析；
[0008]檢索出基因座位不保守的基因，并且通過比較基因組學(xué)分析確定其與GenBank庫中不具有同源的基因序列作為候選基因；
[0009]將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫；
[0010]對候選基因進(jìn)行克隆、測序、比對分析，并檢測基因的表達(dá)情況；
[0011]將驗(yàn)證正確，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄的基因確定為分子診斷的靶基因；
[0012]收集多種形態(tài)各異的具有同一寄主的病原微生物，并將候選基因進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證其特異性。
[0013]進(jìn)一步的，將特異性好的靶標(biāo)基因制成PCR快速檢測試劑盒，或者制成免疫檢測試劑盒。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法在基因組水平快速查找新型病原生物的物種特異基因，能夠在較短的時間內(nèi)建立新型病原物的特異性分子診斷，適用于突發(fā)疫病、新型變異病原物等病理學(xué)特征未知、傳播途徑未知等人們研究不深入的病原物的快速檢測與診斷。
【附圖說明】
[0015]圖1所示為本發(fā)明實(shí)施例中32號Scaffold上的一端特異基因組區(qū)域的共線性分析圖。
[0016]圖2所示為本發(fā)明實(shí)施例中NbPolk和NbOPI兩個編碼基因的RT-PCR驗(yàn)證圖。
[0017]圖3所示為本發(fā)明實(shí)施例中六種家蠶病原微生物分離株的PCR檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下文將結(jié)合具體附圖詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。
[0019]實(shí)施例
[0020]本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法，包括以下步驟:
[0021]采集新型病原生物的樣本，提取其基因組，構(gòu)建基因組文庫；
[0022]通過NCBI的已發(fā)布的基因組信息，基于看家基因座位的保守性，進(jìn)行染色體或者scaffold逐一對齊，同時進(jìn)行共線性分析；
[0023]檢索出基因座位不保守的基因，并且通過比較基因組學(xué)分析確定其與GenBank庫中不具有同源的基因序列作為候選基因；
[0024]將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫；
[0025]對候選基因進(jìn)行克隆、測序、比對分析，并檢測基因的表達(dá)情況；
[0026]將驗(yàn)證正確，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄的基因確定為分子診斷的靶基因；
[0027]收集多種形態(tài)各異的具有同一寄主的病原微生物，并將候選基因進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證其特異性。
[0028]進(jìn)一步的，將特異性好的靶標(biāo)基因制成PCR快速檢測試劑盒，或者制成免疫檢測試劑盒。
[0029]目前，該發(fā)明已應(yīng)用于家蠶微粒子病的病原檢測上。
[0030]具體實(shí)施舉例:
[0031]分離采集重慶地區(qū)的家蠶微粒子病蠶，提取其total RNA，并進(jìn)行全基因組測序。此后，對家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis CQ1)全基因組4，479個基因進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，通過與其他已發(fā)布的其他微孢子蟲基因組信息，包括Encephalitozoonromaleae，Encephalitozoon intestinalis，Encephalitozoon hellem，Encephalitozoonbieneusi，Nosema cerannae，Vittaforma corneae，Edhazardia aedis，Antonosporalocustae，Vavraia culicis floridiensis，Trichomonas hominis，Nematocida spl 等從人、貓、兔、蜜蜂、按蚊、果蠅等寄主中分離得到的微孢子蟲逐一比較，獲得了 82個家蠶微孢子蟲孤兒基因(orphan gene)，為家蠶微孢子蟲獨(dú)有，并且在GenBank中不存在同源序列及基因家族信息。
[0032]如圖1所示，對NCBI能夠檢索到的近緣物種，于GenBank中下載其基因組序列，左側(cè)為六種已知基因組數(shù)據(jù)的微孢子蟲進(jìn)化關(guān)系，右側(cè)為案例中通過共線性分析得到的感染家蠶的病原微生物特異的靶標(biāo)基因。其中每一列為同源基因及其在基因組中的座位，橫線表示基因組拼接情況及基因間隔距離。將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫；密碼子偏好性顯示，這些基因傾向使用UCG(Ser)和CCG(Pro)兩類密碼子。通過對這82個基因所在scaffold的GC分布特征調(diào)查，結(jié)果篩選到4個為新近插入基因，對這四個基因進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能分類顯示，他們主要參與DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡通路的功能基因，將這類基因單獨(dú)建庫。
[0033]分別設(shè)計(jì)候選基因的上下游特異引物，進(jìn)行T克隆，并測序。將測序結(jié)果匹配度^ 98%的基因作為候選。同時，以家蠶微粒子病蠶total RNA為模板進(jìn)行候選基因的表達(dá)情況分析，并確定其轉(zhuǎn)錄時期，將感病中后期穩(wěn)定表達(dá)的基因作為候選靶標(biāo)基因。
[0034]如圖2所示，分別提取病蠶幼蟲期1-10天，成蟲期(因其為變態(tài)發(fā)育，故分別取蛹、蛾、卵時期)的total RNA，取前面分析得到的候選基因的特異引物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，結(jié)果顯示，分別與家蠶、病原物的對照相比，這兩個基因均在感染后持續(xù)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，適合作為候選靶標(biāo)基因。后經(jīng)測序驗(yàn)證完全匹配，故將驗(yàn)證正確的候選基因單獨(dú)艱苦，并確定為分子診斷的靶基因。
[0035]如圖3所示，選用患6種不同病的家蠶為模板，利用候選基因庫中的靶標(biāo)基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示GENE 1、gene I1、gene IV特異性最好，可以組裝試劑盒。
[0036]目前，將其進(jìn)行家蠶微粒子病LAMP檢測試劑盒制備，其中Genel和GenelV特異性較好，靈敏度達(dá)1 X 105個病原物。
[0037]本發(fā)明是基于對一種感染家蠶的病原微生物——家蠶微孢子蟲為研究對象獲得的一種可推廣、應(yīng)用性強(qiáng)的研究方法。
[0038]此外，該法確立后，對于解決已完成基因組測序的未知病原物、或者快速變異的病原微生物的快速檢測提供了一種行之有效的方法。
[0039]本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法在基因組水平快速查找新型病原生物的物種特異基因，能夠在較短的時間內(nèi)建立新型病原物的特異地分子診斷，適用于突發(fā)疫病、新型變異病原物等病理學(xué)特征未知、傳播途徑未知等人們研究不深入的病原物的快速檢測與診斷。
[0040]本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本文的實(shí)施例進(jìn)行改變。上述實(shí)施例只是示例性的，不應(yīng)以本文的實(shí)施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法，其特征在于，包括以下步驟: 采集新型病原生物的樣本，提取其基因組，構(gòu)建基因組文庫； 通過NCBI的已發(fā)布的基因組信息，基于看家基因座位的保守性，進(jìn)行染色體或者scaffold逐一對齊，同時進(jìn)行共線性分析； 檢索出基因座位不保守的基因，并且通過比較基因組學(xué)分析確定其與GenBank庫中不具有同源的基因序列作為候選基因； 將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫； 對候選基因進(jìn)行克隆、測序、比對分析，并檢測基因的表達(dá)情況； 將驗(yàn)證正確，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄的基因確定為分子診斷的靶基因； 收集多種形態(tài)各異的具有同一寄主的病原微生物，并將候選基因進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證其特異性。2.如權(quán)利要求1所述的快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法，其特征在于，還包括將靶基因制成PCR快速檢測試劑盒或免疫檢測試劑盒的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法。本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測靶標(biāo)的方法在基因組水平快速查找新型病原生物的物種特異基因，能夠在較短的時間內(nèi)建立病新型原物的特異地分子診斷，適用于突發(fā)疫病、新型變異病原物等病理學(xué)特征未知、傳播途徑未知等人們研究不深入的病原物的快速檢測與診斷。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105255998
【申請?zhí)枴緾N201510341295
【發(fā)明人】周澤揚(yáng), 羅潔, 潘國慶, 杜孝田
【申請人】西南大學(xué), 重慶文理學(xué)院
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年6月18日