用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測BRCA1mRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于，檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、檢測用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探針BRCA1-Probe、參照用上下游引物Actin-F/Actin-R探針Actin-Probe；其中，BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA；BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT；BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA；Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT；Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT；Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
【專利說明】用于檢測BRCAImRNA的核酸檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是ー種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技木，能夠?qū)θ祟惾橄侔┲械腂RCAl表達水平進行檢測，可有效的節(jié)約檢測時間，提聞檢測精度。
【背景技術(shù)】[0002]乳腺癌作為女性的常見腫瘤，已成為癌癥死亡的第二大原因。其診斷主要建立在影像學檢查基礎上，缺乏實驗室特異性診斷指標，給早期診斷帶來困難，容易漏診或誤診，而手術(shù)切除又是乳腺癌首選治療方法，但是術(shù)后影響形態(tài)，美觀不佳，對患者造成較大困擾，更有部分患者因此產(chǎn)生的心理陰影，嚴重影響她們的生活質(zhì)量。目前多認為乳腺癌應采取多種方法結(jié)合的綜合治療，原發(fā)病灶的徹底清理是乳腺癌治療的關(guān)鍵。另外早期診斷也顯得尤為重要，早發(fā)現(xiàn)是爭取其良好預后的關(guān)鍵。
[0003]乳腺癌I 號基因(breast cancel susceptibility gene I, BRCA I)是世界上第一個被發(fā)現(xiàn)的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17號染色體長臂上，由包括22個編碼外顯子和2個非編碼外顯子。目前研究發(fā)現(xiàn)，DNA修復是鉬類化療耐藥性產(chǎn)生的主要機制之一。臨床運用表明鉬類藥物的療效存在顯著的個體差異，部分患者獲益，部分患者耐藥并出現(xiàn)毒副作用。大量臨床研究已經(jīng)證實:鉬類藥物的療效與腫瘤組織中BRCAl基因mRNA表達水平密切相關(guān)，即BRCAl基因表達水平低的患者對鉬類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現(xiàn)耐藥。然而，抗微管類化療藥是作用于細胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細胞有絲分裂的。這類藥物時常出現(xiàn)治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個體差異。大量的臨床研究顯示，抗微管藥物的療效與腫瘤組織中BRCAl基因的mRNA表達水平密切相關(guān)，即BRCAl基因表達水平高的患者對抗微管類藥物敏感，反之表達水平低的患者表現(xiàn)耐藥。因而，BRCAl表達水平對于后期的用藥有很重要的指導作用。
[0004]在實際應用中，用于檢測BRCAl表達的方法主要為免疫組化，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，且試驗結(jié)果需要經(jīng)驗豐富的專家來判讀，判讀結(jié)果存在較大的主觀性，一定程度上限制了該法的應用。正是因為免疫組化法存在這些問題，才促使我們探索新的方法來檢測BRCAl表達水平。
[0005]實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時在線檢測，反應BRCAl在組織中的初始含量，試驗節(jié)約了大量的檢測時間，還避免了遺留污染的發(fā)生。常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術(shù)等。其中SYBRGreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針法應用于BRCAl基因檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中檢測BRCAl的不足，本發(fā)明設計了檢測內(nèi)參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術(shù)檢測BRCAl基因。通過調(diào)整兩個基因的引物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應體系和反應條件，開發(fā)了ー種用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒。
[0007]用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于:
[0008]檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、d NTP、Mg2+、檢測用上下游引物BRCAl-F/BRCAl-R 和探針 BRCAl-Probe、參照用上下游引物 Actin_F/Actin-R 探針 Actin-Probe ;其中，
[0009]BRCAl-F: CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA
[0010]BRCAl-R: GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT
[0011 ] BRCAl-Probe:FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA
[0012]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0013]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0014]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG_TAMRA。
[0015]進ー步地，檢測用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為:BRCA1-F: BRCAl-R:BRCAl-Probe 的摩爾比為 2: 2:1。
[0016]參照用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為:Actin-F: Actin-R: Actin-Probe的摩爾比為2:2:1。
`[0017]所述陽性對照品為含有BRCAl基因組的溶液；所述陰性對照品為無BRCAl基因組的溶液。
[0018]RNA提取液可用商業(yè)產(chǎn)品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蠟RNA抽提試劑盒替代。
[0019]使用本發(fā)明的試劑盒，將實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合采用Tapman探針，可以對BRCAlmRNA進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時間。利用雙標準曲線法，將檢測結(jié)果與正常人的表達水平(0.75)相比，能衡量受測者體內(nèi)BRCAl基因表達水平是否正常，該方法是ー種新型的用于評價患者BRCAl表達水平的方法，也有助于患者的后期治療方案的確定。由于引入了“正常人”替代了原有的單純個體檢測，不但能夠?qū)κ軠y者體內(nèi)BRCAl基因表達量進行檢測，同時還能夠與正常水平進行比較，指導后期用藥，可用于輔助臨床上乳腺癌的早期診斷、早期預防及高危人群的篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是陽性檢測結(jié)果示意圖；
[0021]圖2是陰性檢測結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023]本發(fā)明的用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒，包括:
[0024]紅細胞裂解液；
[0025]RNA 提取液:QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
[0026]檢測體系PCR 反應液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2 X )(包括 PCR 緩沖液、d NTP、Mg2+)、BRCAl 引物各 0.8uM、BRCAl-probe (探針)0.4uM ；Actin 引物各 0.8uM、Actin-probe (探針)0.4uM ;其中，
【權(quán)利要求】
1.ー種用于檢測BRCAlmRNA的核酸檢測試劑盒的使用方法，所述核酸檢測試劑盒包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，使用方法包括以下步驟: (I)抽提組織RNA; (2 )將步驟(I)的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (3)配置檢測體系PCR反應液；所述檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、檢測用上下游引物BRCAl-F / BRCAl-R和探針BRCAl-Probe、參照用上下游引物Actin-F/-Actin-R 探針 Actin-Probe ;其中，
BRCA1-F: CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA
BRCA1-R: GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT
BRCAl-Probe:FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ； (4)將樣品加入步驟(3)所述的檢測體系PCR反應液中； (5)利用實時熒光PCR儀對樣品進行檢測； (6)檢測結(jié)果判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用方法，其特征在于BRCAl-F: BRCAl-R: BRCAl-Probe的摩爾比為2: 2:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用方法,其特征在于Actin-F: Actin-R: Actin-Probe的摩爾比為2: 2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1訴述的使用方法，其特征在于所述陽性對照品為含有BRCAl基因組的溶液；所述陰性對照品為無BRCAl基因的溶液。
【文檔編號】G01N21/64GK103451282SQ201310365818
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月27日
【發(fā)明者】方國偉, 周曉犢, 王淑一 申請人:杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司