Eif5a2在制備食管鱗狀細胞癌預后診斷試劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了EIF5A2在制備食管鱗狀細胞癌預后診斷試劑中的應用。實時定量PCR檢測數據表明，EIF5A2在食管鱗癌組織中的表達顯著高于相應的非腫瘤組織。免疫組化數據分析結果顯示：EIF5A2表達與淋巴結轉移，腫瘤浸潤深度和腫瘤分期正相關。Kaplan-Meier分析顯示EIF5A2過表達的病人總體生存率較差(P<0.001)。多變量分析也證明EIF5A2是獨立的預后因子。EIF5A2在食管鱗癌的侵襲和轉移中可能發揮重要作用。進一步的實驗數據證明，EIF5A2的過表達可由基因擴增和缺氧導致；EIF5A2可以結合到HIF1α的啟動子區域，上調HIF1α的表達；EIF5A2可以誘導上皮間質化轉換，促進食管鱗癌的血管形成，進而促進食管鱗癌的侵襲與轉移。敲除EIF5A2能顯著抑制腫瘤細胞遷移，沉默EIF5A2有望成為食管鱗癌治療的潛在靶點。
【專利說明】EIF5A2在制備食管鱗狀細胞癌預后診斷試劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及EIF5A2的新應用，特別涉及EIF5A2在制備食管鱗狀細胞癌的預后診斷試劑中的應用。
【背景技術】
[0002]食管鱗狀細胞癌是世界上腫瘤發病率排名第七，致死率排名第五的常見惡性腫瘤。食管切除術是早期食管癌患者有力的根治性治療。然而，大多數患者癥狀顯現時局部腫瘤已進展到晚期，并且20-30%已發生遠處轉移。轉移是食管癌致死的主要原因，因此確定其具體機制顯得重要而又迫切。像其他實體腫瘤一樣，食管癌的發病機理是一個涉及多基因改變的長期過程。
[0003]真核細胞翻譯起始因子5A2(EIF5A2)是EIF5A家族中高度進化保守的基因之一。EIF5A2作為可能的癌基因在多種人類上皮源性腫瘤內呈高表達，并與腫瘤的分期和/或預后不佳相關。EIF5A2通過多種機制誘導腫瘤發生上皮間質轉化進而促進腫瘤侵襲轉移。EIF5A-MTA1/C-MYC軸可能是上皮源性腫瘤發生侵襲轉移的重要調控通路之一。相關分子機制尚需進一步研究(孟慶彬，于健春，馬志強.EIF5A2在腫瘤中的作用研究進展[J].基礎醫學與臨床，2013，33(001): 123-125.XEIF5A2的過度表達與結直腸癌和肝癌的轉移有關，并且提示了卵巢癌、肺癌、膀胱癌的不良預后。在肝細胞癌中，過度表達的EIF5A2可通過介導上皮間質化轉換而促進腫瘤的侵襲和轉移，這些過度表達的EIF5A2主要在侵犯周圍組織的腫瘤細胞中檢測到。盡管EIF5A2可以促進肝癌與結直腸癌細胞的運動能力，但是目前關于EIF5A2促進腫瘤轉移的確切機制尚進展甚微。
[0004]現有研究中，EIF5A2與食管鱗狀細胞癌預后之后的關系尚未明確。Kim D H，Muto M， Kuwahara Y， et al.Array-based comparative genomic hybridizationof circulating esophageal tumor cells [J].0ncology reports， 2006， 16(5):1053-1059.中指出，EIF5A2在食管鱗狀細胞癌細胞中的表達量的升高有限，不到0.6倍，不適用于作為該腫瘤預后的生物標記物。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供EIF5A2在制備食管鱗狀細胞癌的預后診斷試劑中的應用。
[0006]本發明的另一個目的在于提供一種治療食管鱗狀細胞癌的制劑。
[0007]本發明所采取的技術方案是:
EIF5A2在制備食管鱗狀細胞癌的預后診斷試劑中的應用，EIF5A2高表達表明預后差，EIF5A2高表達的定義為:熒光定量PCR法:癌組織中EIF5A2的表達量超過癌旁非腫瘤組織的2.5倍；免疫組化檢測法:腫瘤組織中染色深度X染色面積高于癌旁非腫瘤組織。
[0008]一種治療食管鱗狀細胞癌的制劑，含有可以減少EIF5A2的表達量的起效因子。
[0009]優選的，起效因子選自可使EIF5A2表達量下降的shRNA、siRNA。
[0010]特別的，shRNA的序列為sh2:
top strand: 5’-CACCGAGGACGACCATGCAAAATACGAATATTTTGCATGGTCGTCC-3’ (SEQ IDNO:1)；
bottom strand:5’-AAAAGGACGACCATGCAAAATATTCGTATTTTGCATGGTCGTCCTC-3’ (SEQ IDNO:2)
或 sh4:
top strand:5’-CACCGCATTCAAGATGGTTACCTTCGAAAAGGTAACCATCTTGAATG-3’ (SEQ IDNO:3)
bottom strand:5’-AAAACATTCAAGATGGTTACCTTTTCGAAGGTAACCATCTTGAATGC-3’ (SEQID NO:4)0
[0011]本發明的有益效果是:
發明人通過實時定量PCR檢測了 71例食管鱗狀細胞癌病例中腫瘤和與相應的非腫瘤組織中EIF5A2的表達差異。EIF5A2在食管鱗癌組織中的表達顯著高于相應的非腫瘤組織(P = 0.05)。與相應的非腫瘤組織相比，在31/71 (43.66%)食管鱗癌病例中檢查到EIF5A2的過表達。232例資料完整的食管鱗癌病例的免疫組化數據分析結果顯示:EIF5A2表達與淋巴結轉移(P〈0.001)，腫瘤浸潤深度(P=0.037)和腫瘤分期(P=O-OOl)正相關。Kaplan-Meier分析顯示EIF5A2過表達的病人總體生存率較差(P〈0.001)。多變量分析也證明EIF5A2是獨立的預后因子。這些結果表明:EIF5A2在食管鱗癌的侵襲和轉移中可能發揮重要作用。
[0012]進一步的實驗數據證明，EIF5A2的過表達可由基因擴增和缺氧導致；EIF5A2可以可以結合到HIFla的啟動子區域，上調HIFl a的表達；EIF5A2可以誘導上皮間質化轉換，促進食管鱗癌的血管形成，進而促進食管鱗癌的侵襲與轉移。敲除EIF5A2能顯著抑制腫瘤細胞遷移，沉默EIF5A2有望成為食管鱗癌治療的潛在祀點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1，EIF5A2在食管鱗癌中的過表達情況；
圖2，EIF5A2的表達可被缺氧誘導并且EIF5A2可以上調HIFl a ； 圖34正5么2可直接調控!1正10的表達；
圖4，沉默EIF5A2能降低細胞運動能力；
圖5，EIF5A2促進腫瘤轉移和血管形成；
圖6，敲除EIF5A2具有潛在治療價值；
圖7，細胞角蛋白免疫組化染色結果圖。
【具體實施方式】
[0014]材料和方法
原發腫瘤組織，組織芯片與免疫組化
食管鱗癌病例是從林州腫瘤醫院外科病理檔案室中連續挑選的(河南，中國)。在這項研究中，所有病例都沒有接受過術前放化療。 組織芯片(TMA)是根據現有技術構建。研究用人體組織經過中山大學涉及人體受試者研究的倫理審查委員會審查和批準。免疫組化染色(IHC)使用標準的免疫化學細染色方法進行。
[0015]原位雜交免疫熒光
EIF5A2基因和3號染色體著絲粒分別用紅色和綠色探針標記。原位雜交免疫熒光按照之前描述進行操作9。
[0016]亞細胞結構分離
根據廠家說明書，使用NucBuster蛋白提取試劑盒分離出胞漿蛋白與胞核蛋白。
[0017]EIF5A2與HIFl α的相互作用
EIF5A2與HIFla的相互作用機制是通過熒光素酶試驗與染色體免疫共沉淀試驗研究的。
[0018]體外遷移試驗
將重懸于無血清培養基的細胞種植于內置8微米膜濾器小室中。細胞被含10%胎牛血清的培養基所吸引。30小時后，細胞被固定、染色、計數。侵襲實驗中，膜濾器為一層基質膠覆蓋。重復3次獨立實驗。
體內轉移試驗
所有的動物實驗均根據對動物保健委員會的指導方針并且經中山大學批準進行。此次研究中使用的是四~六周齡的BALB/c裸鼠。動物根據血行轉移組、淋巴結轉移組、對照組隨機分為三組。注射前2天，使用感染復數為150的腺病毒和對照載體(Ad LacZ)分別對細胞進行感染。經尾靜脈向動物體內注射重懸于PBS中的6X IO5個細胞，或經皮下足墊注射重懸于PBS中的1.5X IO5個細胞。45天后處死所有動物。對肺和肝臟進行檢查。對肝臟表面的腫瘤轉移灶進行計數。將腹股溝淋巴結分離并用10%福爾馬林固定。
[0019]微血管計數
微血管計數是使用CD34抗體對切片進行免疫組化染色后分析的。血管的最高值是在20倍物鏡下計數的。
[0020]分子治療實驗
由于KYSE180細胞優良的成瘤性，用它來做裸鼠成瘤。在治療實驗中，應用了兩步成瘤法。首先，把KYSE180細胞接種到小鼠皮下。當腫瘤直徑長到約8毫米時，將腫瘤分離并切成約I X I毫米碎塊，然后把它們再種植到裸鼠皮下。當腫瘤直徑達到5~6毫米，動物分組如下:PBS組，多西紫杉醇組(TXT)，腺病毒EIF5A2-sh2組，多西紫杉醇+腺病毒EIF5A2_sh2 ;或PBS組，順鉬組，順鉬+腺病毒EIF5A2-sh2組，與順鉬+腺病毒EIF5A2_sh4組。瘤內注射腺病毒(IXlO9 IFU /每個腫瘤)，每周一次，連續四周。腺病毒劑量根據預實驗結果制定。多西紫杉醇用法為:腹腔注射，0.311毫克/只/次(用量根據于40 mg/體表面積計算)，每周一次，連續3周。順鉬用法為:0.2毫克/只/次。每兩周測量一次腫瘤體積來檢測腫瘤生長情況。最后一次腺病毒注射后，處死動物，對腫瘤重量進行測量。實驗中所用的shRNA序列如下:
【權利要求】
1.EIF5A2在制備食管鱗狀細胞癌的預后診斷試劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:EIF5A2高表達表明預后差，EIF5A2高表達的定義為: 熒光定量PCR法:癌組織中EIF5A2的表達量超過癌旁非腫瘤組織的2.5倍； 免疫組化檢測法:腫瘤組織中染色深度X染色面積高于癌旁非腫瘤組織。
3.一種治療食管鱗狀細胞癌的制劑，所述制劑含有可以減少EIF5A2的表達量的起效因子。
4.根據權利要求3所述的制劑，其特征在于:起效因子選自可使EIF5A2表達量下降的shRNA、SiRNA0
5.根據權利要求4所述的制劑，其特征在于:所述shRNA的序列為
【文檔編號】G01N33/574GK103468799SQ201310367825
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月21日
【發明者】關新元, 李焱 申請人:中山大學附屬腫瘤醫院