髓過氧化物酶抗體(MPO-Ab)定量測定試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明屬于臨床免疫學檢測【技術領域】，公開了一種髓過氧化物酶抗體(MPO-Ab)定量測定試劑盒，包括磁分離試劑、酶標記試劑、校準品、清洗濃縮液、底物溶液以及穩定劑。本發明還公開了上述試劑盒的制備方法。本發明還公開了上述試劑盒的檢測方法。本發明制備的試劑盒精確度、靈敏度以及穩定性較好，并且成本低廉，操作簡單，具備廣闊的應用前景。
【專利說明】髓過氧化物酶抗體（MPO-Ab)定量測定試劑盒及其檢測方 法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于臨床免疫學檢測【技術領域】，具體涉及一種髓過氧化物酶抗體（MPO-Ab) 定量測定試劑盒及其檢測方法。
[0002]

【背景技術】
[0003] 血管炎是一組以血管的炎癥與壞死為主要病理改變的炎性疾病，包括血管壁及血 管周圍有炎細胞浸潤，并伴有血管損傷，包括纖維素沉積、膠原纖維變性、內皮細胞及肌細 胞壞死，又稱脈管炎。臨床表現因受累血管的類型、大小、部位及病理特點不同而表現各異。 其常累及全身多個系統（例如皮膚、腎臟、肺、神經系統等），引起多系統、多臟器的功能障 礙，但也可局限于某一臟器。致病因素直接作用于血管壁的為原發性血管炎，在血管炎癥基 礎上產生一定的臨床癥狀和體征者為血管炎疾??；由鄰近組織炎癥病變波及血管壁致病的 為繼發性血管炎。
[0004] 髓過氧化物酶（MP0)又稱過氧化物酶，是一種重要的含鐵溶酶體，存在于髓系細 胞(主要是中性粒細胞和單核細胞）的嗜苯胺藍顆粒中，是髓細胞的特異性標志；它也是抗 中性粒細胞胞漿抗體（ANCA)的主要靶抗原，是嗜中性粒細胞殺滅吞噬微生物的重要物質， 抗MP0抗體屬于ANCA的一種，主要針對中性粒細胞和單核粒細胞的細胞漿成分。64%的新 月體性腎小球腎炎可檢測出抗MP0抗體，顯微鏡下多血管炎患者陽性率為60% ;變應性肉 芽腫性血管炎患者可檢測出抗MP0抗體；韋格納肉芽腫患者陽性率為24%，許多體內和體 外的研究數據都提示抗MP0抗體與血管炎的致病機制有關。
[0005] 臨床檢測髓過氧化物酶抗體的常見方法包括放射免疫分析法以及間接免疫熒光 法等。但這些方法都存在著不足之處。放射免疫分析法是利用同位素標記的與未標記的抗 原，同抗體發生競爭性抑制反應，是一種在無須采用生物測定方法的情況下用于檢測抗原 的實驗室測定方法。該法極其敏感而又極其特異，但其卻需要具備尖端復雜的設備，且成本 也不低。同時，還需要特殊的預防措施，因為其要用到放射性物質。因此，如今放射免疫分 析法在很大程度上已經被ELISA所取代。間接免疫熒光法的基本原理是用特異性的抗體與 載玻片中的抗原結合后形成抗原抗體復合物，繼用熒光抗體與抗原抗體復合物結合，形成 抗原抗體熒光復合物。該方法在分析結果時無法根據分子量的大小區分非特異性識別；操 作相對復雜，需要價格較昂貴的熒光顯微鏡，只能進行定性檢測，不能進行定量測定。
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【發明內容】

[0007] 為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種具備較佳的準確度、精密度和穩定 性的試劑盒。本發明是通過如下技術方案來實現的： 一種髓過氧化物酶抗體（MPO-Ab)定量測定試劑盒，包括磁分離試劑、酶標記試劑、校 準品、清洗濃縮液、底物溶液以及穩定劑； 所述磁分離試劑的制備步驟如下： 一、配制磁微粒緩沖液，以配制1L為例： 1) 、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris12.lg和NaCl8. 5g加入容器中，充分攪拌 至完全溶解； 2) 、稱取BSA5g，量取新生牛血清50mL以及Proclin300 0. 2mL至容器中，充分攪拌至 完全溶解； 3) 、用4M的HC1調pH，控制pH在7. 9-8. 1之間； 4) 、最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0008] 二、制備磁分離試劑： 1) 、取100mg含羧基（C00H)活性基團的磁微粒，用0? 025mol/L，pH4. 5-5的MES緩沖 液10mL混懸； 2) 、加入0. 5-lmL濃度為10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸30-60min; 3) 、磁分離，吸去上清，用0. 025mol/L，pH4. 5-5MES緩沖液10mL重懸； 4) 、加入 0? 02-0.lmg的MP0 抗原，室溫混懸 120-240min; 5) 、磁分離，吸去上清，用磁微粒緩沖液重懸到lmg/mL，完成磁分離試劑的制備。
[0009] 所述酶標記試劑的制備步驟如下： 一、配制酶標記試劑稀釋液，以配制1L為例： 1) 、量取800mL純化水于容器中，稱取H印es6. 06g、NaCl8. 5g加入容器中，充分攪拌 至完全溶解； 2) 、稱取BSA5g，Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL和MgCl20.1g于容器中中，充分攪拌 至完全溶解； 3) 、用4M的HC1調pH，控制pH在7. 5-8. 0之間； 4) 、最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0010] 二、堿性磷酸酶（ALP)與MP0抗體的偶聯 1) 、取lmgMP0抗體，加入10mg/mL的偶聯劑2-IT溶液2-4iiL，室溫靜置20min，加入 0.lm〇L/L的甘氨酸溶液10yL，室溫靜置5min;用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的抗體， 2-8 °C保存備用； 2) 、取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20iiL，室溫靜置30min，用G-25 凝膠柱除鹽，收集活化后的ALP，2-8°C保存備用； 3) 、將上述活化的MP0抗體與活化的ALP混合，2-8 °C條件下靜置12-24h，用 Superdex200凝膠純化柱純化偶聯物，獲得MP0抗體-ALP連接物濃溶液，2-8°C保存備用。
[0011] 4)、將MP0抗體-ALP連接物濃溶液用酶標記物稀釋液稀釋到0. 02-0. 1yg/mL，完 成酶標記試劑的制備。
[0012] 上述校準品的制備步驟如下： 一、配制校準品稀釋液： 1) 、量取600mL純化水于容器中，稱取200mL新生牛血清加入容器中，充分攪拌混合均 勻； 2) 、稱取磷酸氫二鉀3. 4g、磷酸二氫鉀0. 36g、Proclin300 0. 02mL加入容器中，充分 攪拌至完全溶解； 3) 、用4M的HC1調pH，控制pH在7. 0-7. 5之間； 4) 、最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0013] 二、配制校準品：用校準品稀釋液將MP0抗體分別配制為0、5、20、50、150、300U/mL 共6個濃度點。
[0014] 所述清洗濃縮液的制備步驟如下：以配制1L為例： 1) 、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris12.lg和NaCl8. 5g于容器中，充分攪拌至 完全溶解； 2) 、稱取Tween-20 5g、TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）5g，充分攪拌，直至完 全混勻； 3) 、用4M的HC1調pH，控制pH在7. 5-8. 0之間； 4) 、最后定容1000mL，2-8°C保存。
[0015] 所述底物溶液的制備步驟如下：以配制1L為例： 1) 、稱取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2S03 0 . 00 3g和Proclin-300 0.4ml于 1L燒杯中； 2) 、用量筒量取600ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調pH，控制其范圍 在7. 5 - 8. 0之間； 3) 、加入250mlLumi-Phos530后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。 所述穩定劑的制備步驟如下：以配制1L為例： 1) 、稱取乙二胺四乙酸二鈉2. 3g和氯化鎂1. 4g于1L燒杯中； 2) 、用量筒量取900ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調pH，控制其范圍 在7. 2 - 7. 8之間； 3) 、加入50ml甘油后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。
[0016] 本發明的主要創新之處主要在于： 1、本發明試劑盒提供了一種接近均相的反應體系，與該試劑盒現有間接法ELISA技術 相比，本發明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和線性范圍，并且樣本不需要稀釋，反應過程只 需要一步清洗，在出結果時間上大大縮短，實驗操作簡便可靠，并達到了較佳的性能參數。 并且競爭法相對間接法試劑工作濃度要低很多，大大降低了試劑成本。
[0017] 2、本發明公開了一種測定MP0抗體的新技術，使得反應過程更加快速可靠，實驗 數據靈敏有效，在提高產品性能的同時，并且大大降低了產品成本； 3、試劑盒中的磁分離試劑，酶標記物，校準品、清洗液濃縮液等組份均是該反應體系下 的最優配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
[0018] 4、本發明試劑盒的精確度、靈敏度以及穩定性均優于市場同類產品，并且成本低 廉，操作簡單，應用前景廣闊。
[0019]

【具體實施方式】
[0020] 以下將采用具體的實施例來對本發明作進一步的解釋，但是不應當看作是對本 發明創新精神的限制。
[0021] 實施例1、磁分離試劑的制備： 一、磁微粒緩沖液配制過程，以配制1L為例： 1、 量取800mL純化水于容器中，稱取Trisl2.lg和NaCl8. 5g加入容器中，充分攪拌至 完全溶解； 2、 稱取BSA5g，量取新生牛血清50mL，Proclin300 0. 2mL至容器中，充分攪拌至完全 溶解； 3、 用4M的HC1調pH，控制pH在7. 9-8. 1之間； 4、 最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0022] 二、磁分離試劑的制備過程 1、 取含羧基（C00H)活性集團的磁微粒，每克（g)磁微粒(干重）羧基含量不低于0. 3毫 摩爾（mmoL)，具有超順磁性，直徑在0. 5-2ym之間； 2、MP0抗原：可以為天然抗原或重組抗原，純度應超過95% ; 3、 2_嗎啉乙磺酸（MES)、碳二亞胺（EDC)、Tris、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Ifepes)應達到化 學純； 4、 取 100mg磁微粒，用 0. 025mol/L，pH4. 5-5 的MES緩沖液 10mL混懸； 5、 加入0. 5-lmL新鮮配制的濃度為10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸30-60min; 6、 磁分離，吸去上清，用0. 025mol/L，pH4. 5-5MES緩沖液10mL重懸； 7、 加入0? 02-0.lmg的MP0抗原，室溫混懸120-240min; 8、 磁分離，吸去上清，用磁微粒緩沖液重懸到lmg/mL，完成磁分離試劑的制備。
[0023] 實施例2、酶標記試劑的制備： 一、酶標記試劑稀釋液配制過程，以配制1L為例： 1、 量取800mL純化水于容器中，稱取H印es6. 06g、NaCl8. 5g加入容器中，充分攪拌至 完全溶解； 2、 稱取BSA5g，Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL和MgCl20.1g于容器中中，充分攪拌 至完全溶解； 3、 用4MHC1調pH，控制pH在7. 5-8. 0之間； 4、 最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0024] 二、堿性磷酸酶（ALP)與MP0抗體的偶聯 1、MP0抗體，購自北京久峰潤達生物技術有限公司，純度超過95% ; 2、 堿性磷酸酶純度應超過95%，比活性應超過1000U/mg，濃度超過5mg/mL; 3、 取lmgMP0抗體，加入10mg/mL的偶聯劑2-IT(2-亞胺四氫噻吩）溶液2-4iiL，室 溫靜置20min，加入0.lm〇L/L的甘氨酸溶液10yL，室溫靜置5min;用G-25凝膠柱除鹽，收 集活化后抗體，2-8°C保存備用； 4、 取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20iiL，室溫靜置30min，用G-25 凝膠柱除鹽，收集活化后ALP，2-8°C保存備用； 5、 將上述活化的MP0抗體與活化的ALP混合，2-8 °C條件下靜置12-24h，用 Superdex200凝膠純化柱純化偶聯物，獲得連接物濃溶液，2-8°C保存備用。
[0025] 6、將MP0抗體-ALP連接物濃溶液用酶標記物稀釋液稀釋到0. 02-0. 1iig/mL，完成 酶標記試劑的制備。
[0026] 實施例3、校準品的制備： 一、校準品稀釋液的配制： 1、 量取600mL純化水于容器中，稱取200mL新生牛血清加入容器中，充分攪拌混合均 勻； 2、 稱取磷酸氫二鉀3. 4g、磷酸二氫鉀0. 36g、Proclin300 0. 02mL加入容器中，充分攪 拌至完全溶解； 3、 用4M的HC1調pH，控制pH在7. 0-7. 5之間； 4、 最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0027] 二、校準品的配制： 1、用校準品稀釋液將MP0抗體分別配制為0、5、20、50、150、300U/mL共6個濃度點。
[0028] 實施例4 :清洗濃縮液的制備： 清洗濃縮液配制過程，以配制1L為例： 1、 量取800mL純化水于容器中，稱取Tris12.lg和NaCl8.5g于容器中，充分攪拌至 完全溶解； 2、 稱取Tween-20 5g、TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）5g，充分攪拌，直至完 全混勻； 3、 用4M的HC1調pH，控制pH在7. 5-8. 0之間； 4、 最后定容1000mL，2-8°C保存。
[0029] 實施例5:底物溶液的制備： 底物溶液配制步驟，配制1L: 1、 稱取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2S03 0 . 00 3g和Proclin-300 0.4ml于 1L燒杯中； 2、 用量筒量取600ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調PH，控制其范圍 在7. 5 - 8. 0之間； 3、 加入250mlLumi-Phos530后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。 實施例6穩定劑的制備： 1、 稱取乙二胺四乙酸二鈉2. 3g和氯化鎂1. 4g于1L燒杯中； 2、 用量筒量取900ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調pH，控制其范圍 在7. 2 - 7. 8之間； 3、 加入50ml甘油后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。 實施例7 本發明試劑盒的測試方法如下： 1、 檢測管內依次加入20iiL樣本(或標準品)、50iiL磁分離試劑、50iiL酶標記試劑以 及穩定劑2iiL，混合均勻，37 ±0. 5°C條件下反應10min; 2、 檢測管放至磁分離器上，靜置2分鐘；倒出上清液； 3、 清洗濃縮液用純化水稀釋15倍后（即為清洗液)使用，加300yL清洗液至檢測管中， 置混勻器上振蕩混勻30s。
[0030] 4、再重復步驟2、3、2兩遍。
[0031] 5、加150iiL底物溶液至檢測管中混勻后進行檢測。
[0032]實施例8 本發明實施例1-6制備的試劑盒的分析性能評價： (1)靈敏度評價 檢測"0"濃度樣本，重復檢測20次，計算相對發光強度（RLU)的平均值(M)和標準差 (SD)，并計算M-2SD值，根據零濃度校準品和相鄰校準品之間的濃度-RLU進行兩點回歸擬 合得出一次方程，將M-2SD值帶入上述方程中，求出對應的濃度值，即為最低檢測限。本方 法的靈敏度不大于0. 5U/mL。其中，A點發光值參見表1 :

【權利要求】
1. 一種髓過氧化物酶抗體（MPO-Ab)定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括磁 分離試劑、酶標記試劑、校準品、清洗濃縮液、底物溶液以及穩定劑。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁分離試劑的制備步驟如下： 一、 配制磁微粒緩沖液，以配制1L為例： 1) 、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g加入容器中，充分攪拌 至完全溶解； 2) 、稱取BSA 5g，量取新生牛血清50mL以及Proclin300 0. 2mL至容器中，充分攪拌至 完全溶解； 3) 、調pH，控制pH在7.9-8. 1之間； 4) 、最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、 制備磁分離試劑： 1) 、取100mg含羧基活性基團的磁微粒，用0? 025mol/L，pH4. 5-5的MES緩沖液10mL 混懸； 2) 、加入0. 5-lmL濃度為10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸30-60min ; 3) 、磁分離，吸去上清，用0. 025mol/L，pH4. 5-5 MES緩沖液10mL重懸； 4) 、加入 0? 02-0. lmg 的 MP0 抗原，室溫混懸 120-240min ; 5) 、磁分離，吸去上清，用磁微粒緩沖液重懸到lmg/mL，完成磁分離試劑的制備。
3. 如權利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標記試劑的制備步驟如 下： 一、 配制酶標記試劑稀釋液，以配制1L為例： 1) 、量取800mL純化水于容器中，稱取H印es 6. 06g、NaCl 8. 5g加入容器中，充分攪拌 至完全溶解； 2) 、稱取 BSA 5g，Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL 和 MgCl20.1g 于容器中，充分攪拌至 完全溶解； 3) 、調pH，控制pH在7.5-8. 0之間； 4) 、最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、 堿性磷酸酶（ALP)與MP0抗體的偶聯 1) 、取lmg MP0抗體，加入10mg/mL的偶聯劑2-IT溶液2-4iiL，室溫靜置20min，加入 0. lm〇L/L的甘氨酸溶液10 y L，室溫靜置5min ;用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的抗體， 2-8 °C保存備用； 2) 、取1. 5mg的ALP，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 ii L，室溫靜置30min，用G-25凝膠 柱除鹽，收集活化后的ALP，2-8°C保存備用； 3) 、將上述活化的MP0抗體與活化的ALP混合，2-8 °C條件下靜置12-24h，用 Superdex200凝膠純化柱純化偶聯物，獲得MP0抗體-ALP連接物濃溶液，2-8°C保存備用； 4) 、將MP0抗體-ALP連接物濃溶液用酶標記物稀釋液稀釋到0. 02-0. 1 y g/mL，完成酶 標記試劑的制備。
4. 如權利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述校準品的制備步驟如下： 一、配制校準品稀釋液： 1 )、量取600mL純化水于容器中，稱取200mL新生牛血清加入容器中，充分攪拌混合均 勻； 2) 、稱取磷酸氫二鉀3. 4g、磷酸二氫鉀0. 36g、Proclin300 0. 02 mL加入容器中，充分 攪拌至完全溶解； 3) 、調pH，控制pH在7. 0-7. 5之間； 4) 、最后用純化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、配制校準品：用校準品稀釋液將MPO抗體分別配制為0、5、20、50、150、300U/mL共6 個濃度點。
5. 如權利要求1-4任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述清洗濃縮液的制備步驟如 下：以配制1L為例： 1) 、量取800mL純化水于容器中，稱取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g于容器中，充分攪拌至 完全溶解； 2) 、稱取Tween-20 5g以及Triton X-100 5g，充分攪拌，直至完全混勻； 3) 、調pH，控制pH在7.5-8. 0之間； 4) 、最后定容1000mL，2-8°C保存。
6. 如權利要求1-5任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述底物溶液的制備步驟如下： 以配制1L為例： 1) 、稱取 NaCl 8.87g、Tris 3.72g、Na2S03 0 . 00 3g 和 Proclin-300 0.4ml 于 1L燒杯中； 2) 、用量筒量取600ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調pH，控制其范圍 在7. 5 - 8. 0之間； 3) 、加入250ml Lumi-Phos 530后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。
7. 如權利要求1-6任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述穩定劑的制備步驟如下： 以配制1L為例： 1) 、稱取乙二胺四乙酸二鈉2. 3g和氯化鎂1. 4g于1L燒杯中； 2) 、用量筒量取900ml純化水于1L燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調pH，控制其范圍 在7. 2 - 7. 8之間； 3) 、加入50ml甘油后，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。
【文檔編號】G01N33/535GK104459107SQ201410136534
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年4月5日 優先權日:2014年4月5日
【發明者】于大為, 楊曉勇 申請人:北京中航賽維生物科技有限公司