：本發明涉及一種利用高效液相色譜快速且同時分析玉米組織提取物中三種苯并噁嗪類化合物的檢測方法，屬于植物化學分析領域。

背景技術：
：苯并噁嗪(Benzoxazine)是禾本科作物中普遍存在有抗蟲，抗菌效應的一類次生代謝產物，其中化合物2,4-二羥基-1,4-苯并噁嗪-3-啉酮(DIMBOA)、2,4-二羥基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-啉酮(DIMBOA)和6-甲氧基-2-苯噁唑啉酮(MBOA)是玉米中最為主要的苯并噁嗪類防御物質，對害蟲和病原菌有明顯的防御作用。如玉米根系和葉片中的DIMBOA分別可以影響玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)和灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)的生長發育，并對害蟲具有致畸效應。玉米葉片中的DIMBOA可以抑制玉米大斑病菌的孢子萌發和菌絲的生長。目前，DIMBOA在玉米種的合成代謝途徑已大致清晰，DIBOA是DIMBOA合成的直接前體，而MBOA則是DIMBOA降解的直接產物。目前，有報道利用乙醚萃取的方法提取玉米植株中的苯并噁嗪類化合物，且利用1％的甲酸或冰乙酸作為流動相(A)，1％甲醇作為洗脫相(B)，在不同的濃度梯度洗脫條件下，流動相(A)：0min，70％；2min，70％；19min，40％；21min，0％；洗脫相(B)：0min，30％；2min，30％；19min，60％；21min，100％；DIMBOA的出峰時間在10min，而MBOA的出峰時間則在16min，而流速為1mL/min，進樣量為50μL，色譜柱溫為25℃，檢測波長為260nm，進行DIMBOA和MBOA的檢測。該檢測方法的持續時間較長，而且在提取過程中DIMBOA于水中或光照條件下易分解，影響試驗進程及結果，不能真實地反應出DIMBOA在植物體內的含量。另外，有關玉米植株體內DIBOA的檢測未見報道。因此，迫切需要建立一種可以快速提取并同時檢測DIBOA、DIMBOA和MBOA的方法，用于玉米植株體內苯并噁嗪類化合物的快速定量檢測，為玉米抗病蟲資源的評價提供技術支撐。本發明提供一種利用高效液相色譜快速且同時檢測玉米組織提取物中三種苯并噁嗪化合物(DIBOA、DIMBOA和MBOA)含量的方法，經文獻檢索，未見與本發明相同的公開文獻報道。

技術實現要素：
：本發明的目的在于克服現有技術中苯并噁嗪提取和檢測方法易降解、耗時的不足，而提供一種利用高效液相色譜快速且同時檢測玉米組織提取物中三種苯并噁嗪化合物(DIBOA、DIMBOA和MBOA)含量的方法。本發明是這樣實現的：1、玉米樣品的提取：取玉米的根或葉片于液氮中磨碎至粉末狀；將粉末置于15mL預先加入5mL乙酸乙酯的樣品管，混勻后放置60min，期間混勻3次；恢復至室溫的萃取液在振蕩器上渦旋震蕩2分鐘呈懸浮狀；上述懸浮液經雙層滅菌濾紙過濾于100mL心形旋蒸瓶中，用5mL乙酸乙酯沖洗2次，共15mL濾液；濾液經旋轉蒸發儀于40℃旋蒸至干燥狀，然后用500μL甲醇充分溶解后置于1mL棕色樣品瓶中，密封保存于-80℃；2、樣品檢測：采用Agilent1200高效液相色譜儀和ExtendC18100×4.6mm色譜柱進行檢測。取1mL磷酸溶入999mL的滅菌水配置成0.1％的磷酸作為流動相(A)，而將100％甲醇作為洗脫相(B)進行濃度梯度洗脫；流動相(A)：0min，80％；10min，30％；10.5min，0％；洗脫相(B)：0min，20％；10min，70％；10.5min，100％；流速為0.5mL/min，色譜柱溫為30℃，進樣量為5μL，檢測波長為254nm。出峰時間則為：DIBOA7.420min，DIMBOA8.186min，MBOA9.747min。本發明的有益效果在于：1、本發明的樣品提取方法有效降低了提取液中DIMBOA降解為MBOA的速率，能比較真實地反應玉米植株體內DIMBOA的含量。2、本發明的檢測方法能夠同時檢測玉米根系或葉片組織提取物中DIBOA、DIMBOA和MBOA的含量，同時避免了樣品洗脫時與水的接觸機率，降低了DIMBOA降解為MBOA的速度，而且減少了色譜試驗時間，為苯并噁嗪的化學定量分析提供了一種簡便有效的方法。附圖說明：圖1為DIBOA、DIMBOA、MBOA標準品以及待測樣品高效液相色譜圖。圖中：A.DIBOA標準品；B.DIMBOA標準品；C.MBOA標準品；D.樣品。具體實施方式：下面結合附圖對本發明作進一步的說明、1、玉米組織中苯并噁嗪類化合物的提取1)磨碎：一株三葉期玉米的根或葉片于液氮中磨碎至粉末狀；2)萃取：將粉末置于15mL預先加入5mL乙酸乙酯的樣品管，60min；期間混勻3次；3)震蕩：恢復至室溫的萃取液在振蕩器上渦旋震蕩呈懸浮狀，2分鐘；4)過濾：上述懸浮液經雙層滅菌濾紙過濾于100mL心形旋蒸瓶中，用5mL乙酸乙酯沖洗2次，共15mL濾液；5)旋蒸：濾液經旋轉蒸發儀于40℃旋蒸5min，至干燥狀，用500μL甲醇充分溶解；6)保存：將500μL甲醇溶解液置于1mL棕色樣品瓶中，密封保存于-80℃；2、提取液中苯并噁嗪類化合物的定量分析該試驗采用Agilent1200高效液相色譜儀和ExtendC18100×4.6mm色譜柱進行檢測。取1mL磷酸溶入999mL的滅菌水配置成0.1％的磷酸作為流動相(A)，而將100％甲醇作為洗脫相(B)進行濃度梯度洗脫；流動相(A)：0min，80％；10min，30％；10.5min，0％；洗脫相(B)：0min，20％；10min，70％；10.5min，100％；流速為0.5mL/min，色譜柱溫為30℃，進樣量為5μL，檢測波長為254nm。圖1分別為DIBOA、DIMBOA、MBOA標準品和待測樣品的出峰時間，而樣品中三類化合物的樣品出峰時間如(圖1.D)所示，誤差分別為0.02min、0.012min和0.027min。