發(fā)明涉及到一種熒光探針法測(cè)定人血清蛋白濃度及識(shí)別其與牛血清蛋白的方法，屬于生物大分子含量及結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在臨床診斷中，尿液中人血清蛋白的識(shí)別鑒定是腎臟疾病的早期信號(hào)，并且人血清中蛋白含量的不足也能預(yù)示提示肝功能的衰竭。除此之外，在生物化學(xué)或藥理學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，低成本的牛血清白蛋白(BSA)被廣泛用來替代人血清白蛋白(HSA)。然而，牛血清白蛋白只有75.8％的生物功能與人血清白蛋白相似，是不能代替人血清蛋白去替換流體并幫助手術(shù)患者修復(fù)血容量的。因此，在治療過程中區(qū)分人血清蛋白和牛血清蛋白，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白含量的定量檢測(cè)就顯得尤為重要。目前，針對(duì)白蛋白檢測(cè)的免疫化學(xué)方法層出不窮，但多數(shù)由于程序較為復(fù)雜且試劑和儀器較昂貴，不利于日常檢測(cè)。而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高且無破壞性的非共價(jià)熒光探針技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。

本文報(bào)道了一個(gè)合成簡(jiǎn)單，成本低廉的熒光探針，DB-15C5。DB-15C5具有典型的扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移特征，因此在生理緩沖體系(PBS緩沖液)中幾乎沒有熒光，若一旦進(jìn)入到HSA或者BSA結(jié)構(gòu)中，就會(huì)發(fā)出綠色熒光，而對(duì)比其他幾種蛋白并沒有明顯現(xiàn)象。DB-15C5與HSA結(jié)合后的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于與BSA結(jié)合的熒光強(qiáng)度，紫外燈下照射就可以看出其區(qū)別，可以實(shí)現(xiàn)快速鑒別人血清蛋白和牛血清蛋白。熒光強(qiáng)度與HSA濃度之間存在很好的劑量關(guān)系，可以作為一種靈敏的HSA識(shí)別探針試劑，定量測(cè)定生理緩沖液以及人工尿液中血清蛋白的含量。探針試劑的濃度50μM，能對(duì)5μM的人血清蛋白進(jìn)行識(shí)別。生理緩沖液中定量檢測(cè)人血清蛋白范圍0-5.6μM，最低檢測(cè)限0.112mg/L；人工尿液中范圍0.0-1.2μM，最低檢測(cè)限1.95mg/L。此類方法較為直觀，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高和成本低廉等特點(diǎn)，值得推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單，靈敏度高和成本低廉的熒光探針法測(cè)定人血清蛋白濃度及鑒別其與牛血清蛋白。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

(1)合成熒光探針試劑DB-15C5：稱量二苯氨基-4-苯甲醛0.27g(1mmol)，加入50毫升三頸瓶中，溫度設(shè)定為85℃，加入無水乙醇，加熱回流至剛好全溶。稱量4-氨基苯并-15-冠-5-醚0.28g(1mmol)，加入無水乙醇溶解，緩慢滴加到醛溶液中，冷凝回流4h，反應(yīng)完成后靜置過夜，析出黃綠色晶體，過濾，真空干燥得到產(chǎn)物DB-15C5。

(2)熒光識(shí)別HSA測(cè)定方法：取DB-15C5母液10μL于石英熒光比色皿中，再加入1mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待測(cè)液。加入蛋白儲(chǔ)備液200μL，在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置360nm為激發(fā)波長(zhǎng)，磷酸鹽緩沖液體系激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為2.5，5nm，人工尿液體系均為2.5nm。得到DB-15C5在不同蛋白存在時(shí)的熒光光譜。

(3)定量測(cè)定HSA含量：通過DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)的熒光光譜，固定發(fā)射波長(zhǎng)500nm，讀取熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度(I)對(duì)HSA濃度(C_HSA)作圖，建立得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定DB-15C5在未知樣品中的熒光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到HSA含量。

所述熒光試劑DB-15C5的結(jié)構(gòu)以核磁共振(NMR)譜以及質(zhì)譜(MS)鑒定：¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ8.637(s,1H),7.720(d,J＝8.8Hz,2H),7.319(m,4H),7.154(m,8H),6.890(m,3H),4.191(m,4H),3.937(t,J＝4.8Hz,4H),3.772(s,8H).¹³C NMR(CDCl₃,100MHz):δ158.144,150.535,149.499,147.322,146.944,146.285,129.667,129.560,129.438,125.356,123.926,121.615,114.579,112.566,107.789,71.066,71.022,70.526,70.417,69.658,69.517,69.444,68.759.HRMScalcd for C₃₃H₃₄N₂O₅[M+Na]⁺561.2665,found 561.2665，產(chǎn)率33.4％，產(chǎn)品純度95％以上。

所述的熒光測(cè)定時(shí)溶液配制緩沖液所用水均為二次蒸餾水或更高純度的水。

所述的緩沖液為由NaCl 8g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄ 1.44g(如果是Na₂HPO₄·12H₂O，則3.63g)溶于1000mL水中配制而成。

所述的人工尿液由尿素1.02068g,乳酸0.0099088g,檸檬酸0.042028g,碳酸氫鈉0.210025g,氯化鈣0.027745g,氯化鈉0.52596g,七水硫酸鎂0.049294g,硫酸鈉0.14204g,磷酸二氫鉀0.095263g,磷酸氫二鉀0.159754g,氯化銨0.133725g溶于100ml蒸餾水并調(diào)節(jié)pH為6.0配制而成。

根據(jù)權(quán)利要求1所述的DB-15C5溶液配制采用1％(v％)乙醇助溶。

所述的熒光光譜需要在熒光分光光度計(jì)上測(cè)試得到。

本發(fā)明將用于熒光鑒別HSA與其他蛋白，尤其是HSA與BSA，并可以定量檢測(cè)HSA。

DB-15C5在生理緩沖液中的熒光強(qiáng)度非常微弱，一旦進(jìn)入到HSA結(jié)構(gòu)中，就會(huì)發(fā)出綠色熒光，而對(duì)比其他幾種蛋白并沒有明顯現(xiàn)象。DB-15C5與HSA結(jié)合后的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于與BSA結(jié)合的熒光強(qiáng)度，紫外燈下照射就可以看出其區(qū)別，可以實(shí)現(xiàn)快速鑒別人血清蛋白和牛血清蛋白。熒光強(qiáng)度與HSA濃度之間存在很好的劑量關(guān)系，可以作為一種靈敏的HSA識(shí)別探針試劑，定量檢測(cè)HSA含量。此類鑒別方法較為直觀，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高和成本低廉等特點(diǎn)，值得推廣。

附圖說明

圖1為檢測(cè)試劑DB-15C5的合成路線。

圖2為熒光試劑DB-15C5(50μM)在人工尿液中(左)、加入HSA(10μM)(中)、加入BSA(10μM)(右)體系中的熒光圖。

圖3為熒光試劑在PBS體系中對(duì)不同蛋白的熒光響應(yīng)圖譜(A)及在不同蛋白中的熒光強(qiáng)度(B)。

圖4為PBS體系中DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)的熒光光譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5為熒光試劑在人工尿液中對(duì)不同蛋白的熒光響應(yīng)圖譜(A)及在不同蛋白中的熒光強(qiáng)度(B)。

圖6為人工尿液體系中DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)的熒光光譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7為不同pH中，DB-15C5(50μM)和DB-15C5+HSA(5μM)的熒光強(qiáng)度。

圖8為分子對(duì)接計(jì)算得到的DB-15C5與HSA結(jié)合能最低時(shí)的結(jié)合模式。

具體實(shí)施方式

下述試驗(yàn)和實(shí)例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。

(1)在PBS介質(zhì)中，DB-15C5用于鑒別HSA和BSA，方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準(zhǔn)確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時(shí)，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取DB-15C5母液10μL于石英熒光比色皿中，再加入1mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待測(cè)液。加入蛋白儲(chǔ)備液200μL，在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置360nm為激發(fā)波長(zhǎng)。激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為2.5，5nm。在370～700nm范圍進(jìn)行掃描，得到DB-15C5在不同蛋白存在時(shí)的熒光光譜(圖3)。

DB-15C5由于TICT性質(zhì)，在PBS體系中幾乎沒有熒光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速點(diǎn)亮化合物熒光，熒光強(qiáng)度增加了接近32倍，靈敏度較高。相比之下，DB-15C5在BSA體系中，熒光強(qiáng)度僅為前者的1/6，可以明顯區(qū)分HSA與BSA。

(2)PBS介質(zhì)中DB-15C5定量測(cè)定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準(zhǔn)確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時(shí)，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取1.0×10^-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英熒光比色皿中，加入960μL磷酸鹽緩沖液混合均勻，依次加入HSA溶液(0～8.0μM)，在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置360nm為激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為5nm，10nm，在370～700nm范圍進(jìn)行掃描，得到DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)的熒光光譜(圖4)。

讀取DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)、發(fā)射波長(zhǎng)500nm的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度(I)對(duì)HSA濃度(C_HSA)作圖，建立得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(I＝191.6047+1152.3207C_HSA,R²＝0.9955)。線性范圍0.0to 5.6μM，檢測(cè)限1.7nM(0.112mg/L)。測(cè)定DB-15C5在樣品中的熒光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到HSA含量。

(4)人工尿液介質(zhì)中DB-15C5定量測(cè)定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準(zhǔn)確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時(shí)，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取DB-15C5母液10μL于石英熒光比色皿中，再加入1mL人工尿液(pH 6.0)，得到5.0×10-5mol/L的待測(cè)液。加入蛋白儲(chǔ)備液200μL，在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置360nm為激發(fā)波長(zhǎng)。激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)均為2.5nm。在370～700nm范圍進(jìn)行掃描，得到DB-15C5在不同蛋白存在時(shí)的熒光光譜(圖5)。

DB-15C5由于TICT性質(zhì)，在尿液中幾乎沒有熒光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速點(diǎn)亮化合物熒光，熒光強(qiáng)度增加了接近32倍，靈敏度較高。除此之外，DB-15C5也有較好的選擇性，我們一共測(cè)試了八種蛋白的熒光響應(yīng)圖譜，發(fā)現(xiàn)HSA，BSA，酪蛋白能夠點(diǎn)亮化合物熒光，但是在HSA中熒光明顯比后兩者強(qiáng)。說明DB-15C5可以實(shí)現(xiàn)人工尿液中的HSA識(shí)別。

(5)人工尿液中DB-15C5定量測(cè)定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準(zhǔn)確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10^-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同時(shí)，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0×10^-4mol/L溶液備用。

取1.0×10^-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英熒光比色皿中，加入960μL人工尿液混合均勻，依次加入HSA溶液(0.0–1.2μM)，在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置360nm為激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫調(diào)為5，10nm，在370～700nm范圍進(jìn)行掃描，得到DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)的熒光光譜(圖6)。

讀取DB-15C5在不同濃度HSA存在時(shí)、發(fā)射波長(zhǎng)500nm的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度(I)對(duì)HSA濃度(C_HSA)作圖，建立得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(I＝1166.0110+1845.8791C_HSA,R²＝0.9954)，檢測(cè)限：29.5nM(1.95mg L^-1)。測(cè)定DB-15C5在樣品中的熒光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到HSA含量，將計(jì)算得到的含量值與實(shí)際加入值相比較，得到回收率(表1)，判斷方法可行。

表1.標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定結(jié)果

(4)pH對(duì)檢測(cè)體系影響小

檢測(cè)體系較為穩(wěn)定。由圖7看出，在不同pH條件下，體系的熒光強(qiáng)度值變化不大，尤其是在pH 6-10之間，體系熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，因此，在生理環(huán)境及產(chǎn)生異樣的情況下，HSA含量檢測(cè)不受影響。

(5)DB-15C5對(duì)HSA產(chǎn)生特異性識(shí)別的工作原理

借助分子對(duì)接理論模擬，得出DB-15C5與HSA產(chǎn)生結(jié)合的位點(diǎn)。如圖8所示，DB-15C5可以進(jìn)入到HSA位于subdomains IIA(Sudlow site I)和IIIA(Sudlow site II)的α-螺旋區(qū)域，結(jié)合自由能達(dá)到-10.47kcal/mol。結(jié)合中冠醚基團(tuán)與組氨酸His242殘基之間有氫鍵作用力表明冠醚基團(tuán)在識(shí)別過程中發(fā)揮重要作用。