本發明屬于光學顯微技術領域，具體涉及一種實現雙近紅外波長激勵稀土摻雜上轉換納米材料的受激輻射發光損耗方法，以及利用上述發光損耗方法的超分辨成像方法及顯微成像裝置。

背景技術：

在常規的光學成像過程中，根據阿貝原則，光學系統所能夠達到的極限分辨率大小約為入射光波長的一半。為了提高分辨率，科學家們提出了許多種突破衍射極限的方法，統稱為超分辨成像方法。其中一種重要方法就是受激輻射損耗術(Stimulated Emission Depletion,STED)。STED超分辨顯微技術需同時使用兩束激光，即用于激發納米探針發射熒光的激發光束，以及用于將激發光斑外圍熒光強行淬滅的空心光束。在傳統STED技術中，通過受激輻射的方法，位于激發光斑外圍的染料發光能級粒子數被損耗激光大量消耗，從而達到損耗外圍熒光發光，縮小光斑尺寸，提高分辨率的目的。相比較其他的超分辨成像方法，STED不僅可以達到納米級的分辨率，并且能夠實現視頻速度的快速成像，因此成為了生物、醫學研究中的一種重要方法。不僅如此，結合雙光子激勵(Two-Photon Excited,TPE)方法，TPE-STED方法將激發波長從紫外、可見波段轉移到近紅外波段，極大降低激光對生物組織損傷的同時，也顯著地提高了成像深度。

但就目前而言，STED技術在深度組織超分辨成像中仍然面臨一定的限制和挑戰，主要體現在：(1)損耗激光仍然位于可見光波段，在生物組織中散射嚴重，在較大的深度中很難達到理想的損耗效果。(2)基于STED原理的損耗光功率較大，會對生物組織造成嚴重的熱損傷。(3)目前常用的STED熒光發光染料普遍存在光漂白或者光閃爍的問題，達不到足夠的光穩定性，不能滿足長時間成像的需要。(4)成像所使用的光源為高功率飛秒光源，價格昂貴且光學系統復雜，難以推廣。

技術實現要素：

本發明的主要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種雙近紅外激勵受激輻射損耗方法，該方法突破傳統受激輻射發光損耗的局限，使用稀土摻雜上轉換納米材料作為STED納米探針，通過對上轉換過程中涉及的一個或多個能級進行受激輻射激勵，實現對上轉換納米材料發光的高效率光控損耗。使用稀土摻雜上轉換納米材料作為STED納米探針可以將發光損耗波長從可見光波段移至紅外波段，從而解決了現有技術中損耗光的散射問題，打破了傳統多光子STED技術的深度限制，同時，稀土摻雜上轉換納米材料無光漂白、光閃爍，可實現無限長時間的實時成像，具有傳統STED染料所不具備的光穩定性。

本發明的另一個目的在于提供一種基于上述受激輻射損耗方法的超分辨成像方法，該方法結合了多光子超分辨技術及上轉換納米材料本身的優點，使得激發波長和損耗波長都位于近紅外波段，解決了深度組織超分辨成像中損耗波長散射嚴重的問題，從而確保在較大深度的成像中也可以實現超分辨成像，上轉換納米材料無光漂白、光閃爍的特性為長時間穩定成像提供了保證。

本發明的另一個目的在于提供一種基于上述超分辨成像方法的顯微成像裝置，該裝置中的激發光和損耗光都可用連續光激光器，具有成本低的優點。

本發明的目的通過以下的技術方案實現：一種受激輻射損耗方法，包括以下步驟：

(1)利用近紅外激發光激發稀土摻雜上轉換納米材料產生上轉換發光；所述稀土摻雜上轉換納米材料中的稀土離子按照功能不同分為敏化劑、激活劑；

(2)增加一束近紅外損耗激光激勵樣品材料，這束近紅外損耗激光通過引起受激輻射過程，將激活劑中涉及上轉換過程的特定能級的電子強迫躍遷至低能級，并輻射光子，近紅外損耗激光的波長與受激輻射上下能級的能量間隙匹配；

(3)上一步驟發生的受激輻射過程根據損耗路徑的不同，會直接或間接地損耗發光能級粒子數，從而實現對發光能級發光的損耗。

優選的，步驟(2)中所述涉及上轉換過程的特定能級包括激活劑中的發光能級、上轉換過程中的中間亞穩態能級或能量轉移上轉換能級。

優選的，步驟(1)中，所述稀土摻雜上轉換納米材料是一種在納米晶體中摻雜稀土離子的復合型納米材料，所述納米晶體采用氟化物或者氧化物，以納米晶體作為基質，在其中摻雜一種或多種鑭系稀土元素離子；

步驟(1)中，所述稀土摻雜上轉換納米材料基于稀土離子豐富的實能級，其敏化劑通過基態吸收對近紅外激發光進行吸收后，通過能量傳遞上轉換、激發態吸收將能量傳遞給激活劑，再由激活劑通過上轉換過程發射出紫外、可見或是近紅外波段的光，即激發出上轉換發光。

優選的，所述敏化劑、激活劑的具體功能如下：

A：在第一激光器激發下，敏化劑吸收單個激發光的光子并將能量傳遞給激活劑；

B：激活劑吸收一個或多個敏化劑傳遞的能量后發生上轉換過程并發射出上轉換發光；

C：在第二激光器激勵下，激活劑中一個或多個涉及上轉換過程的特定能級的粒子通過受激輻射過程被大量消耗，導致發光能級粒子數急劇下降，上轉換發光得到損耗；

所述近紅外激發光與近紅外損耗激光的波長波段均位于760nm-2000nm之間。

一種基于上述受激輻射損耗方法的超分辨成像方法，包括以下步驟：

在一路，第一激光器發出一束穩定的近紅外波長激光，該激光經過準直擴束鏡、小孔光闌濾波處理后，獲得聚焦的高斯型實心光斑；

同時在另一路，第二激光器產生穩定的近紅外波長激光，該激光經過準直擴束鏡、小孔光闌濾波后，再經過空間相位調制板調制形成空心光束，獲得受激輻射損耗光斑；第二激光器產生的近紅外波長激光的波長能量與激活劑中受激輻射過程上下能級的能量間隙相匹配；

所述聚焦的高斯型實心光斑與所述受激輻射損耗光斑在空間上進行共軸耦合，聚焦的高斯型實心光斑激發稀土摻雜上轉換納米材料產生上轉換發光，受激輻射損耗光斑通過引起受激輻射過程，使激活劑中一個或多個涉及上轉換過程的特定能級的粒子大量損耗，發光能級粒子數因此急劇下降，實現對發光能級所產生發光的損耗；

收集稀土摻雜上轉換納米材料在上述雙光束共軸耦合聚焦光斑作用下發出的光，利用光電探測器檢測上述超分辨上轉換發光信號，進行XYZ方向掃描，得到熒光成像圖片。

一種基于上述超分辨成像方法的顯微成像裝置，包括激發光生成模塊、損耗光生成模塊、偏振分光棱鏡、多光子顯微掃描模塊和光電探測模塊，所述激發光生成模塊用于生成用作近紅外激發光的近紅外穩態激光束，所述損耗光生成模塊用于生成用作近紅外損耗激光的近紅外空心光束；所述偏振分光棱鏡將互相垂直的近紅外穩態激光束與近紅外空心光束在空間上共軛耦合成一束耦合激光束，該耦合激光束通過多光子顯微掃描模塊聚焦在載物臺上標記了稀土摻雜上轉換納米材料的樣品上；光電探測模塊用于檢測上述樣品被激發的超分辨上轉換發光信號。

具體的，所述激發光生成模塊包括第一近紅外連續激光器，以及沿該激光器所發射的激光束方向依次放置的第一濾光片、第一準直擴束鏡、第一二分之一波片、第一偏振片，所述第一近紅外連續激光器發出的激光束經過第一濾光片、第一準直擴束鏡后處理成為一束平行光束，然后利用第一偏振片及第一二分之一波片調節其功率，該光束的波長與稀土摻雜上轉換納米材料的激發波長相匹配。

具體的，所述損耗光生成模塊包括第二近紅外連續激光器，以及沿該激光器所發射的激光束方向依次放置的第二濾光片、第二準直擴束鏡、第二二分之一波片、第二偏振片、空間相位調制板，所述第二近紅外連續激光器發出的激光束經過第二濾光片、第二準直擴束鏡后處理成為一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片調節其功率，然后通過空間相位調制板調制成空心光束，該光束的波長與稀土摻雜上轉換納米材料的激活劑中受激輻射過程上下能級的能量間隙匹配。

具體的，所述多光子顯微掃描模塊包括沿耦合激光束前進方向依次放置的掃描振鏡、高反低透二向色鏡和物鏡，耦合激光束經過掃描振鏡、高反低透二向色鏡(反射近紅外激發光及近紅外損耗激光，透射樣品熒光)后被物鏡聚焦，所述載物臺上的樣品放置在物鏡的焦面上。

具體的，所述光電探測模塊包括依次同軸放置的聚焦透鏡和光電探測器，聚焦透鏡和光電探測器設置在沿耦合激光束前進方向的反方向上，所述光電探測器與外部計算機鏈連接，稀土摻雜上轉換納米材料標記的樣品在近紅外損耗激光的激發下發射沿各個方向上的超分辨上轉換發光，一部分熒光信號被物鏡收集，經過高反低透二向色鏡、聚焦透鏡后由光電探測器接收。

優選的，所述掃描振鏡設置在一旋轉裝置上，旋轉裝置由一計算機控制，該計算機與光電探測器連接。在光電探測器接受完一次檢測的信號后，就發送信號到計算機，然后該計算機通過旋轉裝置控制掃描振鏡旋轉，利用聚焦光斑掃描樣品的方式獲得一幅二維激光掃描熒光圖像。

更進一步的，所述載物臺一側設有用于驅動載物臺沿Z軸方向移動的電機。通過該電機，結合旋轉裝置可以獲得三維激光掃描熒光圖像。

本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果：

1、與傳統的多光子STED技術相比，本發明使用紅外波段激光作為損耗光。在較大深度(400微米)的生物體組織中，傳統STED技術的可見光波段損耗光散射嚴重，不能很好地穿透生物組織，嚴重影響多光子STED技術在深度成像上的表現。與此相比，紅外波段的損耗光在生物組織中散射較小，具有較大的穿透深度。本發明可以解決損耗光的散射問題，打破傳統多光子STED技術的深度限制。

2、本發明的激發光、損耗激光、上轉換發光的波長無光譜重疊，間隔大，上轉換熒光光譜不被過濾即可實現全光譜檢測，提高靈敏度。濾光片二色鏡的自由度大、性能要求低、成本低。

3、與傳統的多光子STED技術相比，本發明的激發光和損耗光都可用連續激光器，價格低易產業化。同時，本發明的顯微成像系統不需要對激發光和損耗光在時間上進行控制，極大地降低了成像系統的復雜度，為推廣多光子超分辨技術及其對應的研究具有重要的作用。

4、本發明所使用的STED納米探針為稀土摻雜上轉換納米材料，具有無光漂白，無光閃爍，超低背景熒光發光等優良特性。本發明結合了這種材料的光學優勢，有利于在超分辨成像中實現無限長時間的實時成像。

5、與其他基于上轉換納米材料作為STED納米探針的發光損耗方法相比，本發明通過近紅外光激勵上轉換納米材料受激輻射的方式實現了極高效率的光控損耗，對STED技術的發展與改良具有重要的價值，同時揭示了稀土摻雜上轉換納米材料作為新型STED發光染料應用的無限前景。

附圖說明

圖1為實施例1受激輻射損耗方法在發光能級的原理示意圖。

圖2為實施例1受激輻射損耗方法在中間亞穩態能級的原理示意圖。

圖3為實施例1受激輻射損耗方法在能量傳遞上轉換能級的原理示意圖。

圖4為本發明實施例1中NaYF₄:18％Yb³⁺/8％Tm³⁺的發光原理圖。

圖5為本實施例1中獲得的材料發射光譜及損耗光譜。

圖6為本實施例1中材料NaYF₄:18％Yb³⁺/8％Tm³⁺的透射電鏡圖。

圖7為本發明實施例3顯微成像裝置的結構示意圖。

圖7中：1—第一近紅外連續激光器、2—第一濾光片、3—第一準直擴束鏡(包括第一小孔光闌)、4—第一二分之一波片、5—第一偏振片、6—偏振分光棱鏡、7-第二近紅外連續激光器、8—第二濾光片、9—第二準直擴束鏡(包括第二小孔光闌)、10—第二二分之一波片、11—第二偏振片、12—空間相位調制板、13—反射鏡、14—掃描振鏡、15—高反低透二向色鏡、16—物鏡、17—稀土摻雜上轉換納米材料或其標記樣品、18—聚焦透鏡、19—光電探測器。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

參見圖1、圖2、圖3，本實施例受激輻射損耗方法中采用的近紅外激發光與近紅外損耗激光的波長波段均位于760nm-2000nm之間，分別用于激發和損耗稀土摻雜上轉換納米材料。稀土摻雜上轉換納米材料是一種在納米晶體中摻雜稀土離子的復合型納米材料，納米晶體采用氟化物或者氧化物，以納米晶體作為基質，在其中摻雜一種或多種鑭系稀土元素離子。稀土摻雜上轉換納米材料中的稀土離子按照功能不同分為敏化劑和激活劑，所述稀土離子中敏化劑、激活劑的具體功能如下：

A：在第一激光器激發下，敏化劑吸收單個激發光的光子并將能量傳遞給激活劑；

B：激活劑吸收一個或多個敏化劑傳遞的能量后發生上轉換過程并發射出上轉換發光；

C：在第二激光器激勵下，激活劑中一個或多個涉及上轉換過程的特定能級的粒子通過受激輻射過程被大量消耗，導致發光能級粒子數急劇下降，上轉換發光得到損耗。

一種受激輻射損耗方法，步驟如下：

(1)利用近紅外激發光激發稀土摻雜上轉換納米材料，其敏化劑通過基態吸收過程(Ground State Absorption，GSA)吸收近紅外激發光，并通過能量傳遞上轉換過程(Energy Transfer Upconversion，ETU)將能量傳遞給激活劑。激活劑的電子得到能量后通過上轉換過程躍遷至高能級，隨后輻射出紫外、可見或是近紅外波段的光，即激發出上轉換發光。

(2)增加一束近紅外損耗激光激勵樣品材料，這束近紅外損耗激光的波長與激活劑中受激輻射過程上下能級的能量間隙匹配，通過引起受激輻射過程，將激活劑中的發光能級(圖1)、上轉換過程中的中間亞穩態能級(圖2)或能量傳遞上轉換能級(圖3)的電子強迫躍遷至低能級，并輻射光子；

(3)上一步驟發生的三種受激輻射情況均會直接或間接地損耗發光能級粒子數，從而實現對發光能級發光的損耗。

如圖4所示，基于上轉換NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺在980nm連續光激發下所發455nm藍光可以被810nm連續光所損耗。在本實施例中，Yb³⁺作為敏化劑，Tm³⁺充當激活劑。

具體實施過程如下：在980nm激光激發下，Yb³⁺通過基態吸收GSA過程吸收980nm光子，基態的電子躍遷至能級F_5/2，獲得能量的Yb³⁺通過能量傳遞上轉換ETU把能量傳遞給Tm³⁺，Tm³⁺中的電子得到能量，經過了三次上轉換躍遷過程：H₆→H₅→F₄→F₂→F₃→H₄→G₄，隨后，通過能量傳遞上轉換過程G₄+H₄→F₄+D₂與H₄+G₄→F₄+D₂，電子躍遷至發光能級D₂。D₂能級電子通過自發輻射躍遷至F₄能級，同時發射四光子455nm藍光。

810nm損耗光的加入使發光能級D₂粒子發生受激輻射，輻射光子的同時躍遷至低能級F₂；使能量傳遞上轉換能級G₄粒子發生受激輻射，輻射光子的同時躍遷至低能級H₅；使能量傳遞上轉換能級H₄粒子發生受激輻射，輻射光子的同時躍遷至低能級H₆；第一種情況直接影響發光能級D₂粒子數，后兩種情況間接影響發光能級D₂粒子數，均使D₂能級粒子數急劇下降，從而達到損耗455nm藍光的目的。

本實施例中的發光損耗結果如圖5所示。在980nm激光激發下，材料NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺發出強烈的455nm藍光。在增加了810nm損耗激光后，材料的藍光發光被急劇損耗，光控損耗效率超過90％。從光譜上看，上轉換發光的波長與激發光、損耗光無光譜重疊，間隔大，亦有利于光譜檢測的進行。

本實施例使用稀土摻雜上轉換納米材料代替傳統STED染料，利用雙近紅外光激發材料受激輻射實現高光控損耗效率，且材料熒光發光無光漂白，光閃爍，這在國際范圍內尚屬首次。圖6展示了此上轉換納米材料的形狀、大小等性質，其顆粒平均直徑為20nm，說明本納米材料非常適合作為熒光標記物并應用于多種場合的生物成像中。

實施例2

本實施例除下述特征外其他結構同實施例1：

基于實施例1中的受激輻射損耗方法，同樣基于上轉換納米材料NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺在980nm激發下所發455nm藍光可以被810nm光所損耗。本實施例提供了一種超分辨成像方法，該方法包括：

在一路，利用波長為980nm的連續激光器發出一穩定的近紅外波長激光，作為激發光，該激光經過準直擴束鏡、小孔光闌濾波處理后，獲得聚焦的高斯型實心光斑；

同時在另一路，利用波長為810nm的連續激光器產生穩定的近紅外波長激光作為近紅外損耗激光，該激光經過準直擴束鏡、小孔光闌濾波后，經過對應810nm波長的空間相位調制板調制并形成空心光束，獲得受激輻射損耗光斑；所述近紅外損耗激光的波長符合Tm³⁺中三種受激輻射情況：D₂→F₂、G₄→H₅、H₄→H₆上下能級的能量間隙；

所述980nm聚焦實心光斑與所述810nm受激輻射損耗光斑空間上進行共軸耦合，980nm聚焦實心光斑激發NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺稀土摻雜上轉換納米材料產生上轉換發光，其中包括455nm的藍光。810nm的受激輻射損耗光斑通過引起受激輻射過程，將激發光斑外圍熒光強行淬滅，具體地，損耗光將Tm³⁺中D₂、G₄、H₄三個能級的粒子強行躍遷至低能級，直接或間接地降低D₂能級的粒子數，從而實現D₂能級455nm藍色發光的損耗；

收集NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺材料在上述雙光共軸耦合聚焦光斑作用下發出的光信號，利用光電探測器進行XYZ方向掃描檢測，得到熒光成像圖片。

實施例3

基于實施例2中的超分辨成像方法，本實施例提供了一種顯微成像裝置，該裝置的結構參見圖7，包括：激發光生成模塊、損耗光生成模塊、偏振分光鏡、多光子顯微掃描模塊和光電探測模塊。所述偏振分光棱鏡將互相垂直的近紅外穩態激光束與近紅外空心光束在空間上共軛耦合成一束耦合激光束，該耦合激光束通過多光子顯微掃描模塊聚焦在載物臺上標記了稀土摻雜上轉換納米材料的樣品上；光電探測模塊用于檢測上述樣品被激發的超分辨上轉換發光信號。

本實施例采用實施例1中的NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺作為上轉換發光標記物。采用中心波長為980nm的第一近紅外連續激光器1，其發出的激光作為熒光標記物的激發光，采用中心波長為810nm的第二近紅外連續激光器7，其發出的激光經過空間相位調制板后形成空心光束作為受激輻射損耗光，探測由上述兩激光束準直共軛耦合聚焦掃描照射后所產生的超分辨四光子熒光信號，實現熒光成像。

具體的，本實施例中激發光生成模塊包括第一近紅外連續激光器1，以及沿該激光器所發射的激光束方向依次放置的第一濾光片2、第一準直擴束鏡(包括第一小孔光闌)3、第一二分之一波片4、第一偏振片5，所述第一近紅外激光器發出的激光束經過第一濾光片、第一準直擴束鏡(包括第一小孔光闌)后處理成為一束平行光束。然后利用第一偏振片及第一二分之一波片調節其功率，該光束的波長與稀土摻雜上轉換納米材料的激發波長相匹配。

損耗光生成模塊包括第二近紅外連續激光器7，以及沿該激光器所發射的激光束方向依次放置的第二濾光片8、第二準直擴束鏡(包括第二小孔光闌)9、第二二分之一波片10、第二偏振片11、空間相位調制板12，所述第二近紅外激光器發出的激光束經過第二濾光片、第二準直擴束鏡(包括第二小孔光闌)后處理成為一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片調節其功率，然后通過空間相位調制板調制成空心光束。該光束的波長與稀土摻雜上轉換納米材料的激活劑中受激輻射過程上下能級的能量間隙匹配。近紅外激發光與近紅外損耗光通過偏振分光鏡6在空間上進行準直共軛耦合。

經過準直共軛耦合的耦合激光束經過多光子顯微掃描模塊聚焦到載物臺上的NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺上轉換納米材料標記的樣品上，產生超分辨四光子熒光信號。多光子顯微掃描模塊包括沿耦合激光束前進方向依次放置的掃描振鏡14、高反低透二向色鏡15、物鏡16，上述超分辨四光子熒光信號為波長455nm的藍光信號，所述掃描振鏡設置在一旋轉裝置上，旋轉裝置由一外部計算機控制，該計算機還與后述光電探測器連接。455nm超分辨四光子熒光信號經過物鏡、高反低通二向色鏡返回后，由光電探測模塊探測該455nm熒光信號。

本實施例中光電探測模塊包括依次同軸放置聚焦透鏡18和光電探測器19。聚焦透鏡和光電探測器設置在沿耦合激光束前進方向的反方向上，所述光電探測器與外部計算機鏈連接。在光電探測器接收完一次檢測信號后，就發送信號到計算機，然后該計算機通過旋轉裝置控制掃描振鏡旋轉，利用聚焦光斑掃描樣品的方式得到一幅二維激光掃描熒光圖像，所述載物臺一側設有用于驅動載物臺沿Z軸方向移動的電機，通過該電機，結合旋轉裝置可以獲得三維激光掃描熒光圖像。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。