本發(fā)明屬于采用儀器對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種對(duì)多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

紫杉烷類化合物是從植物中得到的一大類天然產(chǎn)物，是一組具有三環(huán)五甲基十五碳烯骨架的而萜類小分子活性物質(zhì)群，包括紫杉醇(Taxol)、以及它們的半合成前體10-脫乙酰巴卡亭III（10-DAB）和巴卡亭III（BAT III）等，它們是紅豆杉屬植物特有的次生代謝成分。紫杉烷類中最有名的物質(zhì)是紫杉醇，已于1992年美國FDA批準(zhǔn)用于治療卵巢癌，2011年紫杉醇制劑的國際市場銷售額為37億美元，是目前癌癥治療領(lǐng)域的主要藥物。隨著人們對(duì)紫杉烷類物質(zhì)的關(guān)注，現(xiàn)已從各種紅豆杉植物和細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了400多種紫杉烷。各種紫杉烷的生物和藥用特征不同或強(qiáng)弱各異，取決于紅豆杉的數(shù)量及分布，及其生長環(huán)境和生態(tài)基礎(chǔ)，因此，同時(shí)檢測(cè)生物樣品中主要的紫杉烷，了解紫杉烷的分布特性和代謝規(guī)律，不僅有利于探明紫杉醇的制藥資源，而且有助于揭示各種紫杉烷類在紅豆杉體內(nèi)的生理調(diào)控機(jī)制以及它們之間的關(guān)系和相互作用。

目前在紫杉烷類的同時(shí)檢測(cè)過程中，《中國紅豆杉中多種紫杉烷同時(shí)檢測(cè)的液質(zhì)聯(lián)用方法的建立》《HPLC法測(cè)定不同部位南方紅豆杉中紫杉烷類化合物的含量》等文獻(xiàn)采用的有機(jī)試劑種類和用量均較多，檢測(cè)成本比較高，最低檢測(cè)限濃度較高，不能同時(shí)對(duì)低濃度的紫杉烷類進(jìn)行檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決對(duì)10-DAB、BAT III和Taxol等多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)技術(shù)問題，與現(xiàn)有檢測(cè)方法的不同，在于只選擇了乙腈和水作為流動(dòng)相，并且優(yōu)化了流動(dòng)相洗脫梯度方法，縮短了紫杉烷類的檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)降低了最低檢測(cè)限濃度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

一種同時(shí)檢測(cè)多種紫杉烷類的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

（1）采用乙醇、甲醇或乙腈，配制不同濃度的10-DAB、BAT III和Taxol的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度范圍為0.2 μg/ml~1 mg/ml，然后經(jīng) 0.22或0.45 μm過濾膜過濾，或10000~12000 rpm離心處理，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品；

（2）檢測(cè)儀器：Waters ACQUITY-UPLC，色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 100 mm，2.7 μm，柱溫：20~50℃，流速：0.1~1.0 ml/min，樣品池溫度：5~20℃，進(jìn)樣量1~20 μl，每個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為8~16 min，其流動(dòng)相配制和流動(dòng)相梯度洗脫條件如下：

流動(dòng)相A：色譜乙腈

流動(dòng)相B：含有0~10%（v/v）色譜乙腈的超純水

流動(dòng)相梯度洗脫條件如表1 所示：

表1流動(dòng)相洗脫條件設(shè)置

本發(fā)明所描述的方法適用于其它多種紫杉烷類的同時(shí)檢測(cè)，例如DAB-I，BAT VI，三尖杉寧堿等。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)的方法在用于紫杉烷類10-DAB、BAT III和Taxol同時(shí)檢測(cè)方面的應(yīng)用。主要指的是同時(shí)降低了紫杉烷類10-DAB、BAT III和Taxol最低檢測(cè)限濃度。其中10-DAB、BAT III和Taxol的最低檢測(cè)濃度分別低于為0.14 μg/ml、0.13 μg/ml和0.07 μg/ml。

本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)紫杉烷類10-DAB、BAT III和Taxol的同時(shí)檢測(cè)，減少流動(dòng)相使用的有機(jī)試劑種類，縮短檢測(cè)時(shí)間和降低最低檢測(cè)限濃度：減少流動(dòng)相中有機(jī)試劑的使用，在此方法中，只有有機(jī)試劑乙腈的使用；縮短同時(shí)對(duì)紫杉烷類Taxol、BAT III和10-DAB進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)間。

本發(fā)明中10-DAB、BAT III和Taxol的保留時(shí)間分別為3.753 min、5.578 min和8.767 min；降低對(duì)紫杉烷類Taxol、BAT III和10-DAB的最低檢測(cè)濃度。此方法下，10-DAB、BAT III和Taxol的最低檢測(cè)濃度分別低于0.14 μg/ml、0.13 μg/ml和0.07 μg/ml。

本發(fā)明對(duì)多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)的方法重點(diǎn)考察了流動(dòng)相的選擇，最終選擇了乙腈和水，減少有機(jī)試劑的使用，減少污染。

本發(fā)明對(duì)多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)時(shí)的流動(dòng)相梯度洗脫條件進(jìn)行了摸索，最終提高Taxol、BAT III和10-DAB的分離度，降低保留時(shí)間，縮短檢測(cè)時(shí)間；

本發(fā)明對(duì)多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)裝置和檢測(cè)器進(jìn)行了選擇，最終選擇了 Waters UPLC和PDA檢測(cè)器，能夠降低最低檢測(cè)限濃度，拓寬方法學(xué)的適用濃度范圍；

本發(fā)明可以提高多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)的分離度，縮短紫杉烷類的保留時(shí)間，效率有很大的提高；在本發(fā)明中，配制10-DAB、BAT III和Taxol標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為16.62、16.83和17.17 μg/ml，然后經(jīng)0.22 μm針式濾頭過濾，得到檢測(cè)樣品A。

本發(fā)明中，檢測(cè)儀器：Waters ACQUITY-UPLC，色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 100 mm，2.7 μm，柱溫：50℃，流速：0.5 ml/min，樣品池溫度：10 ℃，進(jìn)樣量1 μl，每個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為14 min，流動(dòng)相A為色譜乙腈，流動(dòng)相B為含有8%（v/v）色譜乙腈的超純水，其流動(dòng)相配置和流動(dòng)相梯度洗脫條件如表2所示：

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件設(shè)置

對(duì)檢測(cè)樣品A按照如上方法進(jìn)行檢測(cè)，得到檢測(cè)樣品A的色譜圖，如圖1所示。

本發(fā)明公開的對(duì)多種紫杉烷類同時(shí)檢測(cè)的方法與現(xiàn)有方案所不同的關(guān)鍵點(diǎn)在于：

（1）本發(fā)明采用UPLC對(duì)10-DAB、BAT III和Taxol同時(shí)檢測(cè)，所使用的流動(dòng)相試劑、梯度洗脫方法、分離柱類型、柱溫、檢測(cè)池溫度和流動(dòng)相流速，并且該方法對(duì)其它多種紫杉烷類的同時(shí)檢測(cè)。具有縮短10-DAB、BAT III和Taxol等紫杉烷類的檢測(cè)時(shí)間；減少檢測(cè)過程中使用的有機(jī)試劑種類和用量的特點(diǎn)。

（2）本發(fā)明的檢測(cè)方法具有降低紫杉烷類10-DAB、BAT III和Taxol的最低檢測(cè)限濃度的特點(diǎn)，根據(jù)信噪比S/N>3確定最低檢測(cè)限，本發(fā)明中10-DAB、BAT III和Taxol的最低檢測(cè)濃度分別低于為0.14 μg/ml、0.13 μg/ml和0.07 μg/ml。

表3 信噪比和最低檢測(cè)限數(shù)據(jù)：

附圖說明:

圖1為10-DAB、BAT III和Taxol三種紫杉烷類的色譜圖；

圖2 為10-DAB、BAT III和Taxol三種紫杉烷類的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。

實(shí)施例1：

本發(fā)明通過乙醇配置不同濃度的10-DAB、BAT III和Taxol的標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 20 μm過濾膜過濾，檢測(cè)儀器：Waters ACQUITY UPLC，色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 100 mm，2.7 μm，柱溫：40℃，流速：0.5 ml/min，樣品池溫度：10℃，設(shè)置流動(dòng)相梯度如表4所示，在此條件下得到標(biāo)準(zhǔn)品的分離色譜圖，如圖2所示：

表4 流動(dòng)相梯度洗脫條件設(shè)置：

實(shí)施例2：

在實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行10-DAB、BAT III和Taxol三種紫杉烷類標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，得到相關(guān)的方法學(xué)數(shù)據(jù)如表5所示：

表5 10-DAB、BAT III和Taxol三種紫杉烷類的方法學(xué)數(shù)據(jù)：

實(shí)施例3

本發(fā)明與目前HPLC檢測(cè)方法相比較，能夠明顯地縮短檢測(cè)時(shí)間，降低最低檢測(cè)限度濃度，對(duì)比結(jié)果如表6所示：

表6 常規(guī)HPLC方法與本發(fā)明相比較：

結(jié)果表明，使用HPLC或者ES-MS對(duì)紫杉烷類進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)時(shí)間均較長，目前檢測(cè)手段中紫杉醇的保留時(shí)間大于20 min，采用此方法后，紫杉烷類的分離度提高，紫杉醇的保留時(shí)間縮短至8.8 min，效率提高50% 以上，同時(shí)可以降低最低檢測(cè)限濃度。