本發明屬于檢測分析領域，具體涉及DNA納米帶模板金顆粒一步法組裝納米項鏈及其制備方法和應用。

背景技術：

DNA納米技術源自美國科學家Seeman在上個世紀80年代提出來的一個想法：利用DNA的堿基互補所形成的周期性規律結構作為蛋白等其他分子結晶的框架，這樣可以為晶體學提供一個理想的研究工具。而在2006年，Rothemund則進一步利用M13噬菌體的長度7249nt的基因組DNA作為主鏈，通過設計人工合成的216條短鏈將其彎曲“折”成了各種二維結構，這就是所謂的“DNA折紙”。該技術具有過程簡單、容易操作和極高產率等優點，目前已廣泛應用于生物傳感、物質檢測、單分子水平分析、疾病診斷及治療等領域。

納米金即指金的微小顆粒，其直徑在1～100nm，由氯金酸通過還原法可以方便地制備各種不同粒徑的納米金，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。納米金顆粒由于具有大的比表面積、高表面能、高的表面活性而展現出小尺寸效應、表面效應和量子表面尺寸效應等特性，使其在催化、光學、電學及生物技術等領域有著廣泛的應用前景。尤其是其能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。

拉曼光譜(Raman spectra)，是一種散射光譜。拉曼光譜分析法是基于印度科學家C.V.Raman所發現的拉曼散射效應，對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息，并應用于分子結構研究的一種分析方法。Feldmann(ühler,P.,Roller,E.M.,Schreiber,R.,Liedl,T.,Lohmüller,T.,&Feldmann,J.Nano Letters,2014(5),2914-2919)和Finkelstein(Pilo-Pais,M.,Watson,A.,Demers,S.,Labean,T.H.,&Finkelstein,G.Nano Letters,2014(4),2099-2104.)兩位學者于2014年就DNA折紙組裝研究表面拉曼增強效應，但迄今為止，尚沒有使用DNA納米帶將金納米顆粒組裝成納米結構，用于拉曼檢測和其他方面的研究和專利文獻報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提出一種簡單易操作的通過DNA納米帶和金納米顆粒組裝構建納米項鏈的方法，通過合成金納米顆粒，與DNA納米帶組裝，構建成納米項鏈結構，納米項鏈有序的結構經過拉曼信號分子修飾后可以使得信號進一步增強，豐富了DNA納米結構的檢測手段。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：基于DNA納米帶模板金顆粒組裝納米項鏈的方法，包含以下步驟：

A：合成制備金納米顆粒；

B：將摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的DNA骨架鏈與摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的訂書釘單鏈按按體積比1:1～1:5混合；

C：加入金納米顆粒，并攪拌混勻；

D：將步驟C的溶液在45℃～25℃條件下梯度退火，形成納米項鏈結構。

進一步，上述金納米顆粒由以下方法制備：

(2.1)將濃度為1％～2％的氯金酸溶液置于加蓋的容器中，攪拌并油浴煮沸；

(2.2)往步驟2.1中的溶液加入摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L的檸檬酸鈉，煮沸

并大力攪拌1min～30min；

(2.3)關閉熱源，大力攪拌1min～30min，靜置直至室溫。

作為優選，上述金納米顆粒為20nm金顆粒。

為進一步增強拉曼光譜分析時的信號，上述金納米顆?？梢越泂sDNA1所示核苷酸序列修飾，包含以下步驟：

(3.1)金納米顆粒溶液與ssDNA1所示核苷酸序列按摩爾比為100:1～20:1混合，攪拌混勻，在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(3.2)將步驟3.1溶液滴加氯化鈉溶液，滴加3～5次，每次滴加不超過5μL，間隔時間0.5～1h，滴加完畢后在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(3.3)采用離心提純法濃縮步驟3.2獲得的溶液，將離心產物常溫保存。

上述離心提純法的離心提純參數優選為9000rpm，10min，離心提純三次。

作為優選，上述2.1步驟中的容器為三頸燒瓶。

作為優選，上述2.1步驟中的油浴的溫度為150℃。

本發明具有以下的優點：

(1)DNA納米帶結構簡單，形成產率高，對外界環境要求低，同時具有精確的空間可尋址性，加入納米金顆粒后避免了繁瑣的標記步驟；

(2)金納米顆?？梢酝ㄟ^化學方法大量合成，大大降低成本；

(3)4-mba信號分子具有很強的拉曼信號，修飾納米項鏈，使其在拉曼檢測中更具有優勢；

(4)借助原子力顯微鏡和透射電鏡對納米項鏈進行表征，因此具有簡便、可靠、低成本、較低的實驗條件要求等優勢。

附圖說明

圖1為納米項鏈結構組裝和檢測示意圖；

圖2為合成20nm金納米顆粒透射電鏡圖；

圖3為合成DNA納米帶AFM圖；

圖4為一步法合成金納米項鏈AFM圖；

圖5為對納米項鏈上修飾4-MBA的拉曼信號檢測結果，其中包含納米項鏈的透射電鏡圖。

具體實施方式

現結合附圖對本發明作進一步詳細說明，以使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚。

本發明中，20nm金納米顆?？梢杂梢韵路椒ㄖ频茫?/p>

(1.1)將濃度為1％～2％的氯金酸溶液置于加蓋的三頸燒瓶中，攪拌并油浴煮沸；

(1.2)往步驟1.1中的溶液加入摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L的檸檬酸鈉，煮沸并大力攪拌1min～30min。

(1.3)關閉熱源，大力攪拌1min～30min，靜置直至室溫待用。

金納米顆粒為經ssDNA1所示核苷酸序列修飾后的金納米顆粒，由以下方法制得：

(2.1)金納米顆粒溶液與ssDNA1所示核苷酸序列按摩爾比為100:1～20:1混合，攪拌混勻，在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(2.2)將步驟2.1溶液滴加氯化鈉溶液，滴加3～5次，每次滴加不超過5μL，間隔時間0.5～1h，滴加完畢后在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(2.3)采用離心提純法濃縮步驟2.2獲得的溶液，將離心產物常溫保存。

在上述準備的基礎上，納米項鏈可以通過以下方法制備：

(3.1)將摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的DNA骨架鏈與摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的訂書釘單鏈按按體積比1:1～1:5混合，加入離心產物并攪拌混勻；

(3.2)將步驟3.1的溶液在45℃～25℃條件下梯度退火。

本發明所述納米項鏈結構構建方法，如圖1所示，如下：在DNA納米帶中的訂書釘鏈伸出捕獲立鏈，利用DNA特異性雜交，將修飾上巰基DNA的金納米顆粒組裝上DNA納米帶，經4-MBA拉曼信號分子修飾后使用拉曼儀器檢測其信號強度。

為便于本領域的技術人員進一步理解和實施本發明，現提供如下的相關實施例：實施例1：關于如何制備20nm金納米顆粒

(1)將質量分數為1％的氯金酸溶液置于加蓋的三頸燒瓶中，攪拌并油浴(150℃)煮沸；

(2)往步驟(1)中的溶液加入摩爾濃度為40mmol/L的檸檬酸鈉，煮沸并大力攪拌10min，使溶液混勻；

(3)關閉熱源，大力攪拌15min，溶液從黃色變成紅色，靜置直至室溫；

(4)反應結束后，采用離心提純法濃縮步驟(3)獲得的溶液，將離心產物分散到超純水中。

通過透射電子顯微鏡表征本實施例制備獲得的20nm金納米顆粒的形貌，結果如圖2所示。從TEM圖結果可見，本實施例制備獲得的金納米顆粒材料粒徑均一、分布均勻，進過測量統計，金納米顆粒的直徑為20±2nm。實施例1制備獲得的金納米顆粒溶液用于實施例2中制備經ssDNA1修飾的金納米顆粒的原料。

實施例2：關于制備經ssDNA1修飾的金納米顆粒

取實施例1中150μL金納米顆粒溶液，制備ssDNA1修飾的金納米顆粒：

(1)將150μL金納米顆粒溶液離心清洗1次，9000rpm離心10分鐘，將離心產物分散到100μL超純水中；

(2)取5μL 100μM的ssDNA1加入到步驟(1)中的溶液，同時加入1.5μL質量分數為1％的十二烷基硫酸鈉溶液，震蕩混勻，置于溫度為37℃、轉速為250rpm的恒溫搖勻儀，震蕩孵育4h；

(3)往步驟(2)溶液中滴加2mol/L的氯化鈉溶液，每次滴加2.5μL，間隔半小時，滴加4次，滴加完畢后，置于溫度為37℃、轉速為250rpm的恒溫搖勻儀，震蕩孵育8h；

(4)步驟(3)反應結束后，采用離心提純法濃縮步驟(3)獲得的ssDNA1修飾的納米金棒，離心提純參數為9000rpm，10min，離心提純三次，最終得到15μL的濃縮金納米顆粒溶液，常溫放置待用。

其中，與末端修飾捕獲鏈的訂書釘鏈互補的SH-DNA序列如下：

5’-TTTTTTTTTTTTTTT AGCGA-3’，(ssDNA1)。

實施例3：關于基于DNA納米帶模板金顆粒的組裝方法

(1)將摩爾濃度為4μmol/L的DNA骨架鏈(nanoribbon-scafford)與摩爾濃度為4μmol/L的訂書釘單鏈(nanoribbon-staple1,Modificatory nanoribbon-staple1,nanoribbon-staple2,nanoribbon-staple3,Modificatory nanoribbon-staple3)按等體積混合，每種鏈各取2μL，加入10μL 1×TAE-Mg緩沖液至20μL，震蕩混勻。再加入例2中濃縮金納米顆粒溶液10μL，震蕩混勻。

(2)將步驟(1)混合溶液置于PCR儀中以0.1℃/10s的速率從45℃～25℃退火，取新解離的云母片，滴入5μL反應后的上述混合物，干燥后，采用原子力顯微鏡進行表征，表征結果見圖3和圖4。

從圖3中可以看出合成的DNA納米帶產率極高，納米帶的長度大概在1μm左右。在圖4中，大部分的DNA納米帶都已與金納米顆粒組裝，組裝金顆粒數目最多的有25個，因為納米帶的長度不均一，所以組裝上的金顆粒數目也不一樣。

其中，DNA骨架鏈和訂書釘單鏈的序列如下：

5’-CAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGACGAGTTGAGAATACGAGTTGAGAATACGAGTTGAGAATCCGACCATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’，(nanoribbon-scafford)。

5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’，(nanoribbon-staple1)。

5’-AAAAAAAAAAAAAAACAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’(Modificatory nanoribbon-staple1)。

5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’，(nanoribbon-staple2)。

5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’，(nanoribbon-staple3)。

5’-AAAAAAAAAAAAAAATCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’(Modificatory nanoribbon-staple3)。

實施例4：關于對納米項鏈拉曼信號檢測

取300目碳支持膜，滴入10μL例3反應后的溶液，常溫干燥后采用透射電子顯微鏡進行表征，表征結果如圖5中的小圖所示，我們可以看到形成的金納米項鏈中各個金納米顆粒間距均一，且平均間距小于5nm。

取長寬為1cm×1cm的硅片，在其光滑面滴入5μL的DNA納米帶、20nm金顆粒和金納米項鏈溶液，靜置10min，使樣品吸附到硅片表面。再往20nm金顆粒和金納米項鏈溶液中滴加4-MBA拉曼信號分子，靜置2h，4-MBA充分附著到金納米顆粒表面。使用拉曼顯微鏡測試三個樣品的拉曼信號(激發光波長為633nm)，結果如圖5所示，信號最低的為DNA納米帶，接近為0；金納米顆粒修飾上4-MBA拉曼信號分子后的信號強度較DNA納米帶高，1075cm^-1和1580cm^-1兩處為4-MBA的信號強度峰；金納米項鏈修飾上4-MBA拉曼信號分子后的信號最強，大約為金納米顆粒的3倍。有以上結果可以得出以下結論：經DNA納米帶組裝的金納米顆粒，由于顆粒間距得以控制，使得拉曼信號分子的檢測強度得到成倍的增強，有力地證實了本發明所述的DNA納米結構檢測信號分子的可靠性。

本發明利用DNA納米結構和納米金獨特優勢，將DNA納米帶和20nm金顆粒組裝成金納米項鏈，該結構與信號分子的結合的方法為各種信號分子的檢測拓展了思路，開辟了新的路徑。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明所限定的范圍。