本發明屬于顯微光譜成像技術領域，涉及一種分光瞳激光差動共焦cars顯微光譜測試方法及裝置，可用于快速檢測各類樣品的微區反斯托克斯散射(cars)光譜，可實現高空間分辨成像與探測。

技術背景

光學顯微鏡在生物醫學領域和材料科學領域被廣泛應用，而隨著現代科學的快速發展，對顯微成像的要求也從結構成像轉向功能成像。1990年，共焦拉曼光譜顯微技術的成功應用，極大的提高了探索微小物體具體組織成分及形貌的可能。它將共焦顯微技術和拉曼光譜技術相結合，具備共焦顯微術的高分辨層析成像特征，又兼有無傷檢測和光譜分析能力，已成為一種重要的材料結構測量與分析的技術手段，廣泛應用于物理、化學、生物醫學、材料科學、石油化工、食品、藥物、刑偵等領域。

傳統的自發拉曼散射成像技術由于拉曼散射本身特性導致其發射信號極弱，即便用高強度的激光激發，要得到一副對比度好的光譜圖像，依然需要很長的作用時間。這種長時間作用限制了拉曼顯微技術在生物領域的應用。基于相干拉曼效應的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)過程能夠很大程度上增強拉曼信號，從而實現快速檢測。相干拉曼效應是通過受激激發的光將分子鎖定在振動能級上，這種方法產生的振動信號的強度與激發光的強度成非線性關系，可以產生很強的信號，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強的能量轉換效率，曝光時間短，對樣品的損害也比較小，同時它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的產生是一個三階非線性光學過程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測光。一般而言，為了減少光源的數量，簡化過程，常用泵浦光代替探測光，它們之間的關系如圖2所示，當泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的頻率之差與拉曼活性分子的振動頻率相匹配時，將激發出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的產生過程包含特定的拉曼活性分子的振動模式和導致分子從基態至激發態振動躍遷的入射光場的相互作用過程，它的能級示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強對cars過程的貢獻，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強對cars過程的貢獻；當wp和ws之間的頻差與拉曼活性分子的振動頻率相匹配時，激發出的信號得到共振增強；

傳統cars顯微術大多采用兩個單波長激光器，只能獲得特定頻譜的光譜信息，而且傳統cars顯微術沒有強調系統的定焦能力，導致實際光譜探測位置往往處于離焦位置。即便離焦位置也能激發出樣品的拉曼光譜并被針孔后的光譜儀探測，但是強度并不能合理表征該點正確的光譜信號強度。在cars顯微系統中，只有當系統精確定焦，才能獲得最佳空間分辨力和最好的光譜探測能力。

上述原因限制了cars顯微系統探測微區光譜的能力，制約了其在更精細微區光譜測試與分析場合中的應用。基于上述情況，本發明提出將系統收集到的樣品表面散射的強于樣品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光進行高精度探測，使其與光譜探測系統有機融合，進行空間位置信息和光譜信息的同步探測，以實現高空間分辨的、高光譜分辨的分光瞳激光差動共焦cars圖譜成像和探測。

本發明專利的核心思想是選用超連續譜脈沖激光器和單波長脈沖激光器作為激發光源，擴大激發光譜范圍，提高光譜激發強度；對接收瑞利光分光瞳激光差動共焦探測系統，利用探測器橫向偏移能夠使分光瞳共焦顯微系統的軸向響應特性曲線產生相移的特性，通過對焦斑進行對稱分割，對兩路信號進行差動處理，實現差動探測。根據差動原理，實現雙極性絕對零點跟蹤測量，精確定焦，進而實現高空間分辨；精確定焦后，進行光譜探測，獲得最佳光譜分辨能力。

技術實現要素：

本發明的目的是為克服現有技術的不足，提出一種高空間分辨的分光瞳激光差動共焦cars顯微光譜測試方法及其裝置。

本發明是通過以下技術方案實現的。分光瞳激光差動共焦cars顯微光譜測試方法，包括以下步驟：

a)超連續譜激光由超連續譜激光器發出，經過帶通濾光片后通過第一二向色鏡與單波長激光器發出的單波長激光匯合，通過調整光路使兩束光束時序一致、空間重合(單波長激光包絡于連續譜激光)；混合光束經過照明光瞳與顯微物鏡會聚在被測樣品上，激發出瑞利光和載有被測樣品光譜特性的cars光；

b)cars光和瑞利光經過第二二向色鏡后分成兩束，其中包含cars光的光束進入光譜探測單元，另一束包含瑞利光的光束進入分光瞳激光差動共焦探測單元；在光譜探測單元中，包含cars光的光束先經過帶通濾光片，濾除光束中的非cars干擾光，然后通過第一會聚鏡會聚通過第一針孔，過濾環境光后再由第二會聚鏡會聚進入光譜儀,獲得cars光譜信息；另一束載有瑞利光的光束通過第三會聚鏡后被光強采集系統進行焦斑分割探測，分別得到探測區域a與探測區域b所對應的信號。

c)對a、b兩個探測區域的信號進行差動相減處理后，得到差動共焦曲線，利用分光瞳激光差動共焦響應曲線的“過零點”與測量物鏡焦點位置精確對應特性，通過“過零點”觸發來精確捕獲激發光斑焦點位置，實現高空間分辨的幾何探測和空間定位。

d)通過計算機處理得到被測樣品表面位置(激發光斑焦點)，通過控制高精度三維掃描平移臺移動，使激光聚焦在被測樣品表面，通過光譜探測單元獲取該點的cars光譜信息。

e)單獨處理瑞利光的信號，可實現高空間分辨的三維尺度層析成像；單獨處理cars光譜信號，可獲得光譜圖像；同時處理瑞利信號和cars光譜信號，可實現高空間分辨的圖譜層析成像，即實現被測樣品幾何位置信息和光譜信息的圖譜合一成像與探測。

特別的，在本發明方法中，照明光瞳和收集光瞳可以是圓形、d形或者其他形狀。

特別的，在本發明方法中，激發光束包括線偏光、圓偏光、徑向偏振光等偏振光束和由光瞳濾波等技術生成的結構光束，由此提高系統光譜信號信噪比和系統橫向分辨率。

特別的，在本發明方法中，通過匹配不同譜帶的濾光片，選擇不同譜段的斯托克斯光，可以實現不同譜段的光譜探測；其中，帶通濾光片與帶通濾光片的濾光譜帶關于單波長激光器的中心波長對稱。

特別的，在本發明方法中，激光發射單元還可以用單波長激光器加光子晶體光纖進行光譜展寬實現，此外，將光譜探測單元中的光譜儀替換成光電點探測器，旋轉偏振片可以實現光譜掃描輸出，進而激發cars光譜并由光電點探測器探測得到cars光譜信號；

本發明提供了一種分光瞳激光差動共焦cars顯微光譜測試裝置包括：光譜激發單元、位于光譜激發單元入射方向的激光發射單元、位于光譜激發單元出射方向的二向色單元、位于二向色單元透射方向的光譜探測單元、位于二向色單元反射方向的差動共焦探測單元、控制整個系統的計算機。激光發射單元由單波長脈沖激光器、超連續譜脈沖激光器、帶通濾光片和第一二向色鏡組成；光譜激發單元由照明光瞳、收集光瞳、測量物鏡、待測樣品和高精度三維掃描平移臺組成；二向色單元即第二二向色鏡；光譜探測單元由帶通濾光片、第一會聚鏡、第一針孔、第二會聚鏡和光譜儀組成；激光差動共焦探測單元由第三會聚鏡及光強采集系統組成。

在本發明裝置中，光強采集系統可以采用雙針孔與二象限探測器結合的方法，實現對艾里斑的分割探測。

在本發明裝置中，光強采集系統可以采用ccd探測器，通過在ccd探測面設置探測區域的位置及大小，實現對艾里斑的分割探測。

在本發明裝置中，光強采集系統可以采用傳導光纖，通過在第三會聚鏡的焦面上，關于光軸對稱放置兩根光纖，實現對艾里斑的分割探測。

在本發明裝置中，可通過增加中繼放大透鏡，放大光強采集系統探測到的艾利斑，以提高分光瞳激光差動共焦測量裝置的采集精度。

有益效果

本發明方法，對比已有技術具有以下創新點：

1、本發明將分光瞳激光差動共焦顯微技術與cars光譜探測技術有機結合，利用分光瞳激光差動共焦曲線“零點”位置與顯微物鏡焦點位置精確對應的特性，精確捕捉激發光斑焦點位置并探測光譜信息，從而實現高空間分辨的光譜層析成像與探測。

2、本發明中利用二向色鏡將瑞利光和載有樣品信息的cars光進行分離，其中瑞利光進入分光瞳激光差動共焦探測單元實現幾何位置探測，cars光進入光譜探測單元實現cars光譜探測，通過精準定焦捕獲激發光斑焦點的光譜信息，提高了系統光譜探測靈敏度。此外，二向色分光裝置可以根據需要調整角度，方便結構裝調。

3、本發明將分光瞳激光差動共焦顯微系統和cars光譜成像系統在結構上和功能上結合，可實現樣品微區幾何參數的層析成像，又可實現樣品微區的光譜探測，還可實現圖譜層析成像。

本發明方法，對比已有技術具有以下顯著優點：

1、本發明采用的分光瞳激光差動共焦探測方式，利用差動相減噪聲相消的特性，抗環境干擾能力強。

2、本發明利用分光瞳激光差動共焦技術對測量聚焦光斑進行高精度定位，并對焦點位置進行實時跟蹤測量，消除溫度和擾動等環境影響，實現cars譜探測始終精確對應最小激發聚焦光斑區域的樣品光譜，大幅提高現有cars顯微鏡的微區光譜探測能力和幾何位置探測能力。

3、本發明采用超連續激光匹配單波長激光作為激發光源，可以實現寬譜帶cars光譜探測。

附圖說明

圖1為摘要附圖，即本發明基本實施圖；

圖2為相干反斯托克斯(cars)光激發原理圖；

圖3為cars光與泵浦光、斯托克斯光的關系圖

圖4為傳統偏振探測顯微光路圖；

圖5為分光瞳激光差動共焦響應曲線圖；

圖6為d形分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖7為結合光瞳濾波器的分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖8為采用雙針孔與二象限探測器的分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖9為采用ccd探測器的分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖10為采用光纖進行探測的分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖11為具有探測焦斑放大系統的分光瞳激光差動共焦cars顯微測試裝置示意圖；

圖12為單激光器光源的分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖；

圖13為高空間分辨分光瞳激光差動共焦cars顯微測試方法與裝置示意圖，即實施例用圖。

圖中，1-激光發射單元、2-單波長激光光源、3-超連續譜激光光源、4-帶通濾光片、5-第一二向色鏡、6-測量物鏡、7-照明光瞳、8-收集光瞳、9-被測樣品、10-高精度三維掃描平移臺、11-第二二向色鏡、12-帶通濾光片、13-第一聚光鏡、14-第一針孔、15-第二聚光鏡、16-光譜儀、17-光譜探測單元、18-分光瞳激光差動共焦探測單元、19-第三聚光鏡、20-光強采集系統、21-探測區域a的曲線、22-探測區域b的曲線、23-第一離軸共焦軸向曲線、24-第二離軸共焦軸向曲線、25-差動曲線、26-光瞳濾波器、27-雙針孔、28-二象限探測器、29-ccd探測器、30-傳導光纖1、31-傳導光纖2、32-中繼放大透鏡、33-偏振分光棱鏡、34-偏振片、35-光子晶體光纖、36-第一反射鏡、37-光學延時線、38-第二反射鏡、39-光電點探測器、40-計算機；

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明。

圖1是分光瞳激光差動共焦cars顯微光譜探測方法示意圖。首先，選用一個單波長脈沖激光器(2)作為泵浦光源和探測光源，由它發出泵浦光(探測光)，然后選用一個頻率與之一致的超連續譜脈沖激光器(3)作為斯托克斯光源，在經過帶通濾光片(4)后得到要求波長范圍內的連續譜激光，通過調節光學結構，使兩束激光通過第一二向色鏡(5)時間一致，空間重合；混合后的光通過照明光瞳(7)及測量物鏡(6)聚焦在被測樣品(9)上；由于在緊聚焦的情況下，相位匹配的條件易滿足，激發出瑞利光和載有被測樣品光譜特性的cars光；cars光和瑞利光經第二二向色鏡(11)后分別到達光譜探測單元(17)和分光瞳激光差動共焦探測單元(18)；其中，光譜探測單元(17)對cars光進行光譜探測，分光瞳激光差動共焦探測單元(18)對瑞利光進行幾何位置探測。

在分光瞳激光差動共焦探測單元(18)中，瑞利光經過第三會聚鏡的會聚，被光強采集系統進行分割探測，得到艾里斑第一微區和艾里斑第二微區強度特性曲線，即第一離軸共焦軸向曲線(23)與第二離軸共焦軸向曲線(24)；將第一離軸共焦軸向曲線(23)與第二離軸共焦軸向曲線(24)做相減處理，即得到分光瞳激光差動共焦曲線(25)，即圖5。

將圓形照明光瞳(7)和收集光瞳(8)替換為其他形狀，如d形，即構成d形分光瞳激光差動共焦cars測試方法，如圖6所示。

通過添加光瞳濾波器(26)來提高光譜探測的空間分辨力，即構成添加光瞳濾波器的分光瞳激光差動共焦cars測試方法，如圖7所示。

光強采集系統(20)可以采用雙針孔(27)與二象限探測器(28)結合的方法，實現對艾里斑的分割探測，如圖8所示。

光強采集系統(20)可以采用ccd探測器(29)，通過改變探測焦面上所設置的微小區域的參數以匹配不同的樣品的反射率，實現對艾里斑的分割探測，從而可以擴展其應用領域，如圖9所示。

光強采集系統可以采用傳導光纖，通過在第三會聚鏡(19)的焦面處，沿光軸對稱放置兩根光纖(30、31)，實現對艾里斑的分割探測，如圖10所示。

可以在分光瞳激光差動共焦探測系統中增加放大系統(32)，以提高分光瞳激光差動共焦測量裝置的采集精度，如圖11所示。

圖12是單激光器激光差動共焦cars顯微測試方法示意圖，作用是將激光發射單元的雙激光器輸入改為單激光器輸入，降低成本；單波長脈沖激光器發出單波長激光，經偏振分光棱鏡(33)分光，透射部分經過偏振片(34)進入光子晶體光纖(35)進行譜帶展寬并用帶通濾波片進行特定要求波長截取，反射部分經第一反射鏡(36)、光學延時線(37)和第二反射鏡(38)后與展寬后的連續譜激光在第一二向色鏡(5)處進行耦合，輸出空間一致、時間一致的混合光束，對被測樣品進行cars光譜激發。其中，光學延時線(37)的作用是保證兩束激光時序重合。進一步將光譜探測單元(17)中的光譜儀(16)替換成光電點探測器(39)，旋轉偏振片(34)改變光束偏振態使光子晶體光纖(37)輸出波長連續變化的譜線作為斯托克斯光，進而實現寬譜帶的cars光譜測量。

實施例

在本實施例中，采用波長為532nm的皮秒激光器作為泵浦光源和探測光源，采用重復頻率與之一致的超連續譜皮秒激光器添加550～650nmm帶通濾光片作為斯托克斯光源，在滿足空間重合，時間一致的條件下混合出射，通過光瞳濾波器獲得結構光束后，記過照明光瞳及測量物鏡緊聚焦在樣品上，此時滿足相位匹配條件，激發出波長范圍在450～515nm的反斯托克斯光(cars)和波長為532nm的瑞利光。

如圖13所示,為分光瞳激光差動共焦cars顯微光譜測試裝置，其測試步驟如下：

首先，在激光發射單元(1)中，超連續譜激光器(3)發出的連續譜激光通過帶通濾光片(4)濾光后得到550～650的寬帶激光，然后與單波長(532nm)激光器(2)發出單色激光在第一二向色鏡(5)處匯合,形成混合光束，其中，這兩束激光重復頻率一致，到達第一二向色鏡(5)時間一致，光束匯合后能夠完全重合(泵浦光斑完全包絡于斯托克斯光斑)；混合光束經過光瞳濾波器，產生結構光束；結構光束通過照明光瞳與測量物鏡緊聚焦在被測樣品(9)上，激發出瑞利光和載有被測樣品(9)光譜特性的cars光。

此時，對樣品掃描可通過以下方式完成：由高精度三維掃描平移臺(10)實現x-y-z方向掃描，或在激光出射后的光路中添加振鏡掃描結構，實現x-y方向掃描，并通過pzt實現軸向掃描。

被測樣品反射回的光束包含斯托克斯光λs、泵浦光λ0、瑞利光λ0、cars光λas；其中，cars光λas和斯托克斯光λs進入光譜探測單元(17)，532nm的泵浦光和瑞利光經第二二向色鏡(11)反射進入分光瞳激光差動共焦探測單元(18)。在光譜探測單元(17)中，由斯托克斯光λs和cars光λas混合的光先經過450～515nm的帶通濾光片(12)后只保留cars光，然后通過第一會聚鏡(13)會聚通過第一針孔(14)，過濾環境光后再由第二會聚鏡(15)會聚進入光譜儀(16)，從而探測得到cars光譜i(λ)，其中λ為被測樣品(9)受激發光所激發出cars光的波長。在分光瞳激光差動共焦探測單元(18)中，瑞利光λ0通過第三會聚鏡會聚，被ccd探測器(29)所接收，通過在ccd探測面上，沿光軸對稱設置探測區域的位置及大小，對艾里斑進行分割探測，得到第一離軸共焦軸向曲線(23)與第二離軸共焦軸向曲線(24)。將兩路信號做差處理，獲得差動信號(25)。分光瞳激光差動共焦響應曲線(25)的“零點”與激發光束的聚焦焦點精確對應，通過響應曲線(25)的“零點”獲得被測樣品(9)表面的高度信息，結合連接高精度三維掃描平移臺(10)的位移傳感器反饋的位置信息通過計算機(40)重構出被測樣品(9)的表面三維形貌i(x,y,z)。

計算機(40)控制高精度三維掃描平移臺(10)，使激光精確聚焦在被測樣品(9)表面，激發出能正確表征被測樣品光譜特性的cars光譜i(λ)，被光譜探測單元(17)采集，通過計算機(40)將位置信息i(x,y,z)和光譜信息i(λ)融合，完成被測樣品(9)的三維重構及光譜信息融合i(x,y,z,r)。此外，計算機系統還貫穿于整個系統，計算機(40)用于實現對高精度三維掃描平移臺的位移控制、分光瞳激光差動共焦信號和cars光譜信號的采集處理以及數據融合處理。

以上，沿激光出射方向，依次放置激光發射單元(1)，照明光瞳(7)、顯微物鏡(6)、被測樣品(9)、高精度三維平移臺(10)，收集光瞳(8)、第二二向色鏡(11)，在第二二向色鏡(11)透射方向放置光譜探測單元(17)，在二向色鏡(11)反射方向放置分光瞳激光差動共焦探測單元(18)。激光發射單元(1)包括超連續譜激光器(3)、帶通濾光片(4)和第一二向色鏡(5)以及單波長脈沖激光器(2)；光譜探測單元(17)中依次放置帶通濾光片(12)、第一會聚鏡(13)、第一針孔(14)、第二會聚鏡(15)、光譜儀(16)；在分光瞳激光差動共焦探測單元(18)中，分別放置第三會聚鏡(19)與ccd探測器(29)。在整個系統中，單波長脈沖激光器(2)、超連續譜激光器(3)、高精度三維掃描平移臺(10)、光譜儀(16)、ccd探測器(29)均受計算機(40)控制，系統得到的三維位置信息和光譜信息也由計算機(40)進行融合處理。

以上結合附圖對本發明的具體實施方式作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發明的范圍，本發明的保護范圍由隨附的權利要求書限定，任何在本發明權利要求基礎上進行的改動都是本發明的保護范圍。