本發明屬于食品安全檢測技術領域，具體的說，涉及一種基于凝膠電泳與化學計量學檢測牛乳中非乳蛋白的方法。

背景技術：

食品安全與人類的生活息息相關，是受到人們廣泛關注的話題。其中，食品摻假是導致食品安全問題的重要方面之一。牛乳因其具有豐富的營養價值，從而廣泛受到消費者的青睞。但是在經濟利益驅動下，向牛乳中添加價值成本低廉的偽蛋白成為了牛乳摻偽的主要途徑之一。摻假其他非牛乳蛋白的目的是提高牛乳蛋白含量，但在此過程中會引入其他結構和不同類型的蛋白，因此采用色譜、質譜及光譜技術雖可達到檢測的目的，但是，由于其相對高昂的成本與對復雜專業儀器設備的要求，限制了其使用的價值。而且，在一些經濟欠發達地區，因檢測資源的缺乏，無法實現色譜、質譜及光譜所需的實驗條件。

技術實現要素：

為克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種成本低廉、操作簡單的檢測方法，具體是基于凝膠電泳(sds-page)與化學計量學檢測牛乳中非乳蛋白摻假的方法。本發明方法用于牛乳中非乳蛋白的鑒偽，得到的結果穩定、快速、準確度高，具有潛在的應用推廣前景。

本發明首先采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)技術，通過蛋白染色和脫色的方法，獲得牛乳和不同摻假類型及比例的牛乳樣品凝膠電泳圖譜。然后，結合主成分分析方法，實現對牛乳中摻假偽蛋白的鑒別。本發明技術方案具體介紹如下。

本發明提供一種基于凝膠電泳與化學計量學檢測牛乳中非乳蛋白的方法，其首先將真實牛乳和待檢測的摻假牛乳樣品進行sds-page電泳，采集凝膠圖譜，用凝膠分析軟件計算得到每個樣品圖譜的相對前沿值、條帶百分比及絕對的體積；然后，結合主成分分析方法，得到真實牛乳和待檢測牛乳樣品的全局可視化主成分得分圖，通過觀測此得分圖，實現對待檢測牛乳樣品中是否摻雜非乳蛋白鑒別的目的。

本發明中，sds-page電泳時，染色劑采用0.1％w/v考馬斯亮藍r250醋酸甲醇溶液，甲醇∶醋酸∶水的體積比為30∶10∶60；脫色劑使用醋酸甲醇溶液，甲醇∶醋酸∶水的體積比為40∶10∶50；分離膠質量濃度為12％，濃縮膠質量濃度為5％。

本發明中，采用主成分分析方法時，先用image-lab軟件對凝膠分析軟件計算得到的每個圖譜的相對前沿值、條帶百分比及絕對的體積進行分析，得到數據集；再將數據集導入matlabr2013a統計分析軟件，數據進行歸一化后進行主成分分析。

本發明中，非乳蛋白是乳清蛋白或者植物蛋白。

本發明中，植物蛋白為大豆蛋白或者豌豆蛋白。

和現有技術相比，本發明的有益效果在于：

本發明的sds-page技術，以其獨特的網狀結構，從而起到分子篩的作用。在電泳過程中，蛋白質可以保證在完整狀態，并根據蛋白分子量大小、形狀及所帶電荷使其成梯度分開。

本發明方法成本低廉、操作簡單快速，結果穩定，準確度提高，在牛乳品質檢測中具有潛在的應用推廣前景。

附圖說明

圖1表示真實牛乳的sds-page圖譜。

圖2表示牛乳中摻入1％的大豆蛋白和豌豆蛋白sds-page圖譜。

圖3表示牛乳中摻入1％的乳清蛋白sds-page圖譜。

圖4表示牛乳中摻入10％的大豆蛋白和乳清蛋白sds-page圖譜。

圖5表示牛乳中摻入10％的豌豆蛋白和乳清蛋白sds-page圖譜。

圖6表示牛乳和摻假大豆蛋白牛乳樣品的pca得分圖。

圖7表示牛乳和豌豆蛋白牛乳樣品的pca得分圖。

圖8表示牛乳和乳清蛋白牛乳樣品的pca得分圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實例對本發明進一步闡述。

具體實施步驟如下：

1.樣品采集和制備

由山東青島采集生鮮原乳16種。非牛乳蛋白7種，分別為2種大豆蛋白，2種豌豆蛋白，3種乳清蛋白。將液態的牛乳樣品凍干，選用一種摻假牛乳為摻假底物，配置成5mg/ml的牛乳母液。10000rpm離心20min。試樣分為三層，上層為牛乳脂肪，中層為可溶性蛋白，取中層進行進一步的分析。按照4種摻假比例：1％，3％，5％，10％(w/w)進行模擬摻假。實驗采用三重復。

2.sds-page凝膠電泳的配置及其染色劑和脫色劑的配置

根據實驗需求配置為12％的分離膠和5％的濃縮膠。配方如下：

本實驗染色劑采用0.1％w/v考馬斯亮藍r250醋酸甲醇溶液(甲醇∶醋酸∶水＝30∶10∶60)，脫色劑使用醋酸甲醇溶液(甲醇∶醋酸∶水＝40∶10∶50)。

3.牛乳和摻假牛乳的sds-page電泳

(1)灌分離膠：將按上述分離膠比例配置好的溶液，緩慢灌入灌膠儀中，由兩玻璃組成的槽中，向其槽中加入200μl異丙醇壓平，防止氣泡產生。

(2)灌濃縮膠：待分離膠凝固后，將上層異丙醇溶液倒掉，用移液槍向其中加入約2ml的濃縮膠，并插入1.5mm厚15孔道的梳子，靜置，待凝固后，收膠，保持濕潤的環境，4℃保存備用。

(3)樣品處理：取50μl的樣品，向其溶液中加入等量的2×laemmli上樣緩沖液，渦旋10s至混勻。隨后，按照5％(v/v)的比例加入β-巰基乙醇，95℃水浴5min，隨后立即取出，冷卻至室溫。蛋白標記采用pm2500彩色分子量標記，其分子量范圍是9-180kda。

(4)sds-page跑膠：將凝固的膠放入電泳槽中，緩慢注入1×電極緩沖液，內槽加滿，小心拔出梳子。取3μl蛋白標記液和10μl的樣品小心加入樣品槽中，打開電源，初始分離膠的初始電壓80v，約20min后待所有孔道中的樣品成直線分布，將電壓調至120v，樣品進入分離膠，約1h，關閉電源。

(5)染色：將整塊膠取下，放入已配置好的考馬斯亮藍染色液中，固定速度，搖床染色1h。

(6)脫色：將染色后的膠置于脫色劑中，搖床脫色三次，每次1h，換液三次。

(7)拍照：使用biorad凝膠成像系統拍照。

4.數據導出

采用伯樂的凝膠分析軟件對所有的sds-page圖像進行處理，得到相對前沿值、條帶百分比及絕對的體積。以乳清蛋白1的10％(w/w)模擬摻假物(w1-4)的條帶為基準，因其擁有最多的蛋白顯色條帶。以此樣品的條帶數和相對前沿為參考，若樣品含有少于w1-4的條帶，則將這些條帶的值設置為0。整理好樣品的原始數據，并用于下一步的分析。

5.主成分分析

首先，根據主成分分析方法(pca)，從而達到一種摻假乳和真實牛乳全局可視化分析。pca是一種常用于數據壓縮和探索性分析的計量學方法.每一主成分是由原始變量通過線性組合構成，且彼此間不相關。pca的輸出結果為得分圖和載荷圖，得分圖可表明樣品的類型及樣品之間的相關性和不同性，而載荷圖用于解釋變量之間的關系。一般而言，通常選擇主成分1和主成分2等對pca得分貢獻最大的主成分作圖。而載荷圖可用線性、柱狀圖和棒狀圖進行呈現，其主要用來表示各個因子對主成分貢獻主要程度。

從圖2和圖3可以看出，當牛乳中摻假植物蛋白如大豆蛋白和豌豆蛋白比例為1％，其sds-page的圖譜與真實牛乳并未看出明顯差異，均有6個條帶。當摻假比例增加到10％，可發現摻假植物蛋白和乳清蛋白的條帶與真實的牛乳具有明顯的差異，摻假大豆蛋白s1的牛乳較純牛乳多出4條明顯的特殊蛋白條帶，其分子量的范圍分布在180-40kda之間。而摻假大豆蛋白s1的牛乳比真實的牛乳多出3條蛋白條帶，因其與s1是不同的大豆蛋白類型。其次，摻假1％豌豆蛋白p1的牛乳樣品與真實的牛乳蛋白條帶未有明顯差異，而摻假1％豌豆蛋白p1的牛乳樣品較真實的牛乳多出一條分子量在60-40kda的蛋白條帶。此外，摻假1％乳清蛋白的牛乳樣品與純牛乳蛋白條帶并無二致，當摻假比例增加到3％時，其較對照組多出3條明顯的條帶，若摻假比例增加到10％時，其摻假w1和w3樣品條帶增至11條，而對摻假w2的樣品條帶數增至9條，其摻假蛋白分子量的范圍分布在180-40kda之間。可見其與對照純牛乳之間有顯著差異。從而得到初步結果，采用sds-page檢測摻假牛乳具有一定的價值和潛力。

因此，將sds-page和計量學手段如主成分結合使用，從而更直觀和準確的反應牛乳摻假檢測的情況。采用image-lab軟件進行分析，得到125×11(樣品×指標)的數據集。分析時將真實牛乳與7種摻假牛乳組成獨立的數據集，其矩陣由56×11構成。將其導入matlabr2013a統計分析軟件，數據進行歸一化后采用主成分分析，其最終結果如6、7、8圖所示。

從圖6中可以看出，當摻假大豆蛋白為s1時，主成分1和主成分2的得分分別是44.72％和34.26％，主成分1對區分真實的牛乳和摻假的牛乳起到主要貢獻作用。此外，尤其當摻假比例達到5％以上時，主成分1能夠將真實和摻假大豆蛋白的樣品清晰的區分開。摻假s2大豆蛋白與真實牛乳的樣品呈現出相似的區分結果。其次，對真實和摻假豌豆蛋白的牛乳，主成分2能夠將其分開。但對于摻假乳清蛋白的牛乳樣品與真實的牛乳而言，檢測限水平達到3％。當摻假水平不小于5％后，pca對摻假樣與真實的牛乳之間有很好的區分效果，與sds-page圖呈現的趨勢，具有良好的統一性。從最終的分析結果可知，sds-page結合pca能夠區分不同摻假類型及比例的摻假樣與真實樣。圖7與圖8得到了其它摻假蛋白的鑒別模型，獲得了一致的效果。通過以上實例，我們將sds-page蛋白檢測技術很好的與計量學技術結合使用，為建立簡潔快速的測定牛乳摻假提供了數據支持和理論思路。并且，檢測方法無需任何蛋白標準品，從而得到該方法具有普遍性與可推廣性。

雖然本發明已將具體實例及具體分析算法一一闡述，然而其并非用以限定本發明的內容，任何熟悉牛乳摻假檢檢測技術和計量學算法研究者，在不脫離本發明的主要精神和內容范圍內，當可作各種更改與潤色，包括引入其他新穎的計量學算法，因此發明的保護范圍應以申請專利的實際權利要求范圍為準。