本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥檢測(cè)，具體地，本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸分離和檢測(cè)分子量的方法。

背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸(hyaluronic?acid,ha)是一種酸性黏多糖，由d-葡萄糖醛酸(d-glucuronic?acid,glca)和n-乙酰葡萄糖胺(n-acetylglucosamine,glcnac)通過(guò)β-1,3糖苷鍵連接構(gòu)成雙糖單元結(jié)構(gòu)，然后又通過(guò)β-1,4糖苷鍵聚合形成的糖胺聚糖。由于ha本身溶解性較差，在使用時(shí)常將其轉(zhuǎn)化為鈉鹽，即透明質(zhì)酸鈉(sodium?hyaluronate，簡(jiǎn)稱sh)。由于聚合程度不同，sh的平均相對(duì)分子質(zhì)量差異很大，而sh的流變特性主要取決于分子量，并決定其生物學(xué)功能和應(yīng)用場(chǎng)景。例如分子量較大的透明質(zhì)酸，具有更強(qiáng)的支撐性、抗降性和黏彈性，因此常作為塑形填充材料應(yīng)用于醫(yī)療美容中；分子量較低的透明質(zhì)酸鈉更易被機(jī)體吸收，可作為天然保濕因子用于化妝品和美容保健食品中；更低分子量的透明質(zhì)酸鈉具有促進(jìn)骨生成和治療細(xì)菌性角膜潰瘍等療效。

2、透明質(zhì)酸鈉的生物活性與其分子量有密切關(guān)系，故應(yīng)根據(jù)使用目的來(lái)選用合適的分子量范圍。隨著應(yīng)用場(chǎng)景與制劑技術(shù)的發(fā)展，將不同分子量范圍的透明質(zhì)酸鈉添加到產(chǎn)品中，獲得多重生物學(xué)效果，成為透明質(zhì)酸鈉類產(chǎn)品的重要研究方向，該類產(chǎn)品中透明質(zhì)酸的不同分子量就成為了關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)。

3、目前，透明質(zhì)酸鈉分子量測(cè)定的方法主要為特性黏度法和分子排阻色譜法(size-exclusion?chromatographic?separation,sec)。特性黏度法獲得的是單一樣品的相對(duì)分子質(zhì)量，涉及不同分子量范圍的透明質(zhì)酸鈉混合物，并不適用于用特性黏度法測(cè)定。sec法根據(jù)溶液中分子體積(流體力學(xué)體積)大小實(shí)現(xiàn)分離的，可同時(shí)測(cè)定平均分子量及其分布情況。國(guó)內(nèi)外藥典普遍采用以shodex?sb-806hq為色譜柱的分子排阻色譜法進(jìn)行檢測(cè)，但該方法僅限于較窄分子量范圍的透明質(zhì)酸鈉分子量檢測(cè)，另外該方法流動(dòng)相中加入起防腐作用的疊氮鈉，屬于劇毒品，易爆炸，有較大安全隱患。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服目前本領(lǐng)域存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)不同分子量范圍透明質(zhì)酸鈉混合物進(jìn)行分離和/或測(cè)定分子量的方法。

2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的：本發(fā)明提供一種通過(guò)凝膠滲透色譜對(duì)不同分子量范圍的透明質(zhì)酸鈉混合物進(jìn)行分離和/或測(cè)定分子量的方法，其中，色譜條件如下：色譜柱為shodex?ohpak?sb-806hq：8.0mm?i.d.*30cm,13μm和shodex?ohpak?sb-804hq：8.0mm?i.d.*30cm,10μm依次串聯(lián)；流動(dòng)相為乙酸銨水溶液；其中待測(cè)的透明質(zhì)酸鈉樣品為1～1800kda分子量范圍的透明質(zhì)酸鈉混合物。

3、進(jìn)一步的，分離和/或測(cè)定分子量的方法中乙酸銨水溶液濃度為0.05～0.2mol/l。

4、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中乙酸銨水溶液濃度為0.08、0.1或0.12mol/l。

5、進(jìn)一步的，分離和/或測(cè)定分子量的方法中色譜柱溫度為25～40℃。

6、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中色譜柱溫度為25、30或35℃。

7、進(jìn)一步的，分離和/或測(cè)定分子量的方法中流速為0.4～0.6ml/min；并且進(jìn)樣體積為20～30μl。

8、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中流速為0.4、0.5或0.6ml/min；并且進(jìn)樣體積為20、25或30μl。

9、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中流動(dòng)相為乙酸銨水溶液，濃度為0.1mol/l；色譜柱溫度為30℃；流速為0.5ml/min；并且進(jìn)樣體積為25μl。

10、進(jìn)一步的，分離和/或測(cè)定分子量的方法中使用至少9個(gè)已知分子量的肝素制備對(duì)照品，用水將其分別稀釋制成濃度0.4～0.6mg/ml的溶液。

11、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中使用至少9個(gè)已知分子量的肝素制備對(duì)照品，用水將其分別稀釋制成濃度0.5mg/ml的溶液。

12、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中肝素的分子量為600da～3200kda。

13、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中肝素的分子量分為低中分子量和高分子量標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)測(cè)定樣品中低中分子量透明質(zhì)酸鈉的和高分子量透明質(zhì)酸鈉進(jìn)行選擇：

14、低中分子量可選擇全套即低分子量混標(biāo)：600、1200、1800、2400、3000、3600、4200、4800、5400、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000、20000、22000、24000、26000、28000、32000、36000、40000da。

15、高分子量可選擇16k、68k、145k、203k、471k、785k、1207k、2070k、3160kda。

16、進(jìn)一步的，分離和/或測(cè)定分子量的方法用水將待測(cè)的透明質(zhì)酸鈉樣品稀釋制成濃度0.4mg/ml～0.6mg/ml的溶液。

17、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中用水將待測(cè)的透明質(zhì)酸鈉樣品稀釋制成濃度0.5mg/ml的溶液。

18、進(jìn)一步的，分離和/或測(cè)定分子量的方法通過(guò)gpc軟件進(jìn)行普適校正計(jì)算線性回歸方程，計(jì)算被測(cè)樣品的分子量。

19、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中按照下面的線性回歸方程計(jì)算被測(cè)樣品的分子量：

20、低中分子量線性回歸方程：

21、f(分子量[n])＝-0.00275648*t3+0.1320164*t2-2.238323*t+17.17206，其中，t為保留時(shí)間，r2＝0.99995。

22、高分子量線性回歸方程：

23、f(分子量[n])＝0.01252043*t3+0.6674033*t2-12.21135*t+82.13413，其中，t為保留時(shí)間，r2＝0.99915。

24、更進(jìn)一步，分離和/或測(cè)定分子量的方法中所述分子量為重均分子量。

25、本發(fā)明中，shodex?ohpak?sb-806hq：8.0mm?i.d.*30cm,13μm和shodex?ohpak?sb-804hq：8.0mm?i.d.*30cm,10μm均為日本昭和電工生產(chǎn)的凝膠滲透色譜柱。

26、由于透明質(zhì)酸鈉特殊的粘彈性，分離與檢測(cè)方法中不存在與其特性相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)與摸索，選擇肝素作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

27、

28、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的有益效果：透明質(zhì)酸應(yīng)用前景非常廣闊，醫(yī)藥、醫(yī)療器械、化妝品、保健品等領(lǐng)域均有涉及，需要加強(qiáng)對(duì)其原料及制劑的質(zhì)量把控，尤其是透明質(zhì)酸分子量測(cè)定方法的特異性、準(zhǔn)確度有待改善。本發(fā)明通過(guò)凝膠滲透色譜對(duì)不同分子量范圍的透明質(zhì)酸鈉混合物達(dá)到較好的分離效果，分子量檢測(cè)結(jié)果具有良好穩(wěn)定性和可重復(fù)性，突破了現(xiàn)有的僅能檢測(cè)單一分子量范圍透明質(zhì)酸鈉分子量的技術(shù)局限性，為不同分子量范圍透明質(zhì)酸鈉混合物有效分離并檢測(cè)分子量提供方法，同時(shí)采用肝素作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。