本發(fā)明涉及生物環(huán)境，尤其涉及一種確定根際微生物脫氮活性維持溫度閾值的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、濕地作為重要的自然生態(tài)系統(tǒng)，具有顯著的氮污染削減能力，在維持水體和土壤生態(tài)平衡方面起著關(guān)鍵作用。然而，隨著農(nóng)業(yè)活動(dòng)、工業(yè)排放和城市化進(jìn)程的加速，大量含氮化合物(如硝酸鹽和氨氮)通過徑流和排水進(jìn)入濕地，導(dǎo)致濕地的氮負(fù)荷過高。長(zhǎng)期氮污染不僅會(huì)破壞濕地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，還會(huì)引發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化、生物多樣性喪失以及溫室氣體(如氧化亞氮)排放增加等一系列環(huán)境問題。目前，濕地氮污染治理技術(shù)主要集中在以下幾方面：機(jī)械曝氣、化學(xué)處理和植物調(diào)控，而這些技術(shù)的核心過程都是微生物驅(qū)動(dòng)的硝化和反硝化過程。

2、然而，現(xiàn)有研究和應(yīng)用中存在以下關(guān)鍵問題：溫度敏感性問題：微生物脫氮活性對(duì)環(huán)境溫度極為敏感，特別是在低溫條件下，濕地脫氮效率顯著降低。目前缺乏針對(duì)微生物脫氮活性的溫度閾值研究，導(dǎo)致在寒冷季節(jié)或寒冷地區(qū)，濕地脫氮功能大幅削弱；缺乏關(guān)鍵參數(shù)指導(dǎo)：現(xiàn)有技術(shù)對(duì)濕地中根際微生物脫氮過程的影響因素研究不夠深入，特別是微生物類群的溫度響應(yīng)特性缺乏系統(tǒng)性分析，無法為濕地修復(fù)工程提供科學(xué)依據(jù)；生態(tài)適應(yīng)性差：許多人工干預(yù)技術(shù)與濕地的自然生態(tài)過程不相容，容易導(dǎo)致濕地生態(tài)失衡甚至進(jìn)一步惡化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種確定低溫條件下濕地根際微生物維持脫氮活性的溫度閾值的檢測(cè)方法，通過逐漸降低環(huán)境溫度，系統(tǒng)采集和檢測(cè)濕地根際土壤的理化性質(zhì)、微生物群落變化以及硝化和反硝化活性，最終計(jì)算出適合脫氮活性維持的溫度范圍。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)科學(xué)性與可操作性：通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證溫度對(duì)根際微生物脫氮過程的定量影響，為濕地修復(fù)提供明確的參數(shù)依據(jù)。(2)適用性廣：該方法可在自然濕地和人工濕地中應(yīng)用，特別適用于寒冷地區(qū)或低溫季節(jié)的濕地氮污染治理。(3)生態(tài)友好：依托植物和微生物的自然作用，避免對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)造成二次污染，同時(shí)促進(jìn)濕地的生態(tài)平衡和功能恢復(fù)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種確定低溫條件下濕地根際微生物維持脫氮活性的溫度閾值的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

4、(1)將濕地植物栽種到試驗(yàn)區(qū)；

5、(2)逐漸降低試驗(yàn)區(qū)的環(huán)境溫度；

6、(3)在不同溫度梯度條件下采集根際土壤樣品和水體樣品；

7、(4)檢測(cè)根際土壤樣品的反硝化活性、活躍微生物群落組成和多樣性變化、土壤理化性質(zhì)、水體氮素濃度變化；

8、(5)計(jì)算功能微生物維持活性的溫度閾值。

9、作為優(yōu)選，步驟(1)中所述植物的種類為挺水植物，所述栽種時(shí)的密度為9～25株/m2。

10、作為優(yōu)選，步驟(2)中所述降低的幅度為每三天降低0.8～1.2℃。

11、作為優(yōu)選，步驟(3)中所述不同溫度梯度分別為：8℃、4℃、0℃、-4℃、-10℃和-15℃。

12、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述根際土壤硝化和反硝化活性的檢測(cè)方法為：

13、將土壤、kno3溶液、葡萄糖溶液和氯霉素溶液混合后置于密閉容器中，將密閉容器抽真空后注入氦氣-乙炔混合氣體，震蕩后抽取密閉容器中的氣體，檢測(cè)n2o的濃度；

14、所述土壤、kno3溶液、葡萄糖溶液和氯霉素溶液的用量比為13～17g：23～27ml：23～27ml：23～27ml；

15、所述kno3溶液的濃度為18～22mg/l；

16、所述葡萄糖溶液的濃度為35～45mg/l；

17、所述氯霉素溶液的濃度為190～197mg/l

18、所述氦氣-乙炔混合氣體中氦氣和乙炔的體積比為85～95：5～15；

19、所述注入氦氣-乙炔混合氣體后密閉容器中的大氣壓和抽真空前的大氣壓相同；

20、所述震蕩的條件為120～130r/min、23～27℃；

21、所述抽取密閉容器中的氣體的時(shí)機(jī)為震蕩開始時(shí)和震蕩開始后的110～130min；

22、所述n2o的濃度采用agilent?7890b氣相色譜儀測(cè)定。

23、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述活躍微生物群落組成和多樣性變化的檢測(cè)方法為：

24、通過rnaprep?pure?kit總rna提取試劑盒提取rna，檢測(cè)提取rna的純度；

25、所述純度的檢測(cè)方法為：對(duì)rna樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增后的rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，將cdna樣品在illumina?hiseq平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序，利用qiime2軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)、分類和注釋。

26、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述土壤理化性質(zhì)包括ph值，no3--n、no2--n、nh4+-n含量，有機(jī)質(zhì)含量，總碳和總氮含量；

27、所述ph值的檢測(cè)方法為：將干燥的土壤和水按照1：2～3的質(zhì)量比混合，震蕩后靜置，用ph計(jì)測(cè)定；

28、所述no3--n、no2--n、nh4+-n含量的檢測(cè)方法為：將土壤和kcl溶液混合，震蕩后過濾，用smartchem200測(cè)定；

29、所述kcl溶液的濃度為：0.8～1.2m，所述土壤和kcl溶液的體積比為1：4～6，所述震蕩的條件為180～220rpm、50～70min；

30、所述有機(jī)質(zhì)含量檢測(cè)時(shí)采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法；

31、所述總碳和總氮含量檢測(cè)時(shí)采用元素分析儀測(cè)定。

32、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述水體氮素濃度變化的檢測(cè)包括no3--n、no2--n、nh4+-n的濃度檢測(cè)和tn含量檢測(cè)；

33、所述no3--n、no2--n、nh4+-n的濃度檢測(cè)時(shí)采用全自動(dòng)化學(xué)分析儀；

34、所述tn含量的檢測(cè)時(shí)采用元素分析儀。

35、作為優(yōu)選，步驟(4)中所述溫度閾值的計(jì)算方法包括如下步驟：

36、a、準(zhǔn)備土壤微生物群落數(shù)據(jù)集和環(huán)境因子數(shù)據(jù)集；

37、b、在微生物群落數(shù)據(jù)中，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以保證每個(gè)樣本的最小抽平序列數(shù)相同；

38、c、利用titan2包中的titan函數(shù)來分析微生物群落中正負(fù)響應(yīng)類群的溫度閾值；

39、步驟a中所述土壤微生物群落數(shù)據(jù)集的獲得方法為：將步驟(5)中微生物測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)silva數(shù)據(jù)庫，生成脫氮微生物群落組成的otu表；

40、步驟a中所述環(huán)境因子數(shù)據(jù)集的獲得方法為：步驟(3)中的溫度梯度作為環(huán)境因子。

41、本發(fā)明還提供了一種用于所述的檢測(cè)方法的裝置，包括內(nèi)層框架和保溫外層；

42、所述內(nèi)層框架的長(zhǎng)度為30～50cm、寬度為30～50cm、高度為50～70cm；

43、所述保溫外層包裹在內(nèi)層框架的四周和底部。

44、在本發(fā)明中，所述內(nèi)層框架的材料為透明塑料，所述保溫外層的材料為epp。

45、本發(fā)明還提供了所述裝置的使用方法，包括如下步驟：

46、所述裝置用于無水環(huán)境模擬時(shí)，將土壤填充至內(nèi)層框架高度的50～70％，在土壤上種植植物后進(jìn)行檢測(cè)；

47、所述裝置用于有水環(huán)境模擬時(shí)，將土壤填充至內(nèi)層框架高度的40～60％，再在內(nèi)層框架中注入水，直至水面高度達(dá)到內(nèi)層框架高度的80～100％，在土壤上種植植物后進(jìn)行檢測(cè)。

48、在本發(fā)明中，所述裝置用于有水環(huán)境模擬時(shí)水層表面在降溫后冷卻成冰層，冰層下方的水層保持流動(dòng)。

49、本發(fā)明提供了一種確定低溫條件下濕地根際微生物維持脫氮活性的溫度閾值的檢測(cè)方法，包括如下步驟：(1)將濕地植物栽種到試驗(yàn)區(qū)；(2)逐漸降低試驗(yàn)區(qū)的環(huán)境溫度；(3)在不同溫度梯度條件下采集根際土壤樣品和水體樣品；(4)檢測(cè)根際土壤樣品的反硝化活性、功能微生物群落組成和多樣性變化、土壤理化性質(zhì)、水體氮素濃度變化；(5)計(jì)算功能微生物維持活性的溫度閾值。濕地在寒冷氣候條件下脫氮效率下降是常見問題。本發(fā)明的技術(shù)方案可以為提升低溫環(huán)境中濕地的脫氮效果提供了技術(shù)支持，使其在冬季或寒冷地區(qū)也能發(fā)揮良好作用。通過明確根際微生物脫氮活性的溫度范圍，可指導(dǎo)濕地修復(fù)工程中植物種類的選擇和生長(zhǎng)條件的調(diào)控，提升濕地的脫氮能力。本方法通過促進(jìn)植物-微生物相互作用優(yōu)化土著微生物功能，還能夠減少外源干預(yù)，節(jié)省治理成本。