專利名稱：一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監(jiān)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監(jiān)控方法，可在生物活性肽的制備過程中動態(tài)監(jiān)測水解過程，實(shí)現(xiàn)水解的可視化，從而最大程度的獲取目標(biāo)活性肽。
背景技術(shù)：
近年來已發(fā)現(xiàn)一些天然免疫活性肽如胸腺肽，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化、增殖與成熟， 提高免疫低下小鼠的免疫活性。然而天然免疫活性肽在生物體中含量較少，制備成本高，價(jià)格昂貴。雖然化學(xué)方法可以大量合成免疫活性肽，但化學(xué)合成的免疫活性肽存在副反應(yīng)和副產(chǎn)物較多的問題，其應(yīng)用和發(fā)展受到限制。而酶法水解具有成本低、安全性好，并且易于大量制備等優(yōu)點(diǎn)，因此目前生物活性肽的制備研究主要集中在酶法水解上面。但是蛋白酶解的程度對于活性肽的免疫效果具有重要的影響，其可以用水解度來表示。隨著對生物活性肽生理功能認(rèn)識的不斷深入，發(fā)現(xiàn)水解度對酶解產(chǎn)物的生物學(xué)活性、 活性組分得率、肽段組成和分子量分布均有影響。適當(dāng)控制酶解條件和水解度可以提高生物活性肽的生成量。例如，對乳鐵蛋白水解產(chǎn)物的抑菌活性與水解度進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在一定水解度范圍內(nèi)(DH小于10% )，隨著乳鐵蛋白水解度的提高，酶解產(chǎn)物的抑菌活性增強(qiáng)，但是水解度過大時(shí)酶解產(chǎn)物的抑菌活性卻發(fā)生下降。因此，確定水解度就對于蛋白酶解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性具有重要作用，而實(shí)現(xiàn)蛋白酶的可控水解也就具有重要的意義。目前國內(nèi)外的可控酶解的理論與方法主要集中在數(shù)學(xué)動力學(xué)模型模擬和酶解進(jìn)程控制上，這為生物活性肽的制備及工業(yè)化應(yīng)用提供了有益的參考。但目前對蛋白酶促水解反應(yīng)的動力學(xué)研究發(fā)展較緩慢，其原因是雖然在方程中引入了產(chǎn)物抑制常數(shù)和底物常數(shù)，但大多仍停留在用米氏方程描述反應(yīng)過程階段。同時(shí)，由于酶解過程是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，易受到各種外界條件影響，如溫度波動、PH變化、酶活變化、攪拌速率不同、底物多樣化等等，使得數(shù)學(xué)動力學(xué)方程十分繁瑣復(fù)雜、難于真實(shí)地描述反應(yīng)的全過程。因此動力學(xué)模型是有局限性的，完全依靠動力學(xué)模型難以實(shí)現(xiàn)酶解的可控操作，新的可控酶解理論與技術(shù)成為生物活性肽制備中亟待解決的重要課題。而生物傳感器可以在線直接或間接監(jiān)測酶解過程中產(chǎn)生的活性肽含量和分子量分布，可以有效實(shí)現(xiàn)活性肽的可控制備，顯示出巨大優(yōu)勢。生物傳感器技術(shù)把生物活性物質(zhì)的檢測，巧妙地與傳感器技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助控制方法相結(jié)合，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測等特點(diǎn)。其原理是在傳感器的化學(xué)電極的敏感面上組裝固定化酶膜，當(dāng)酶膜接觸待測物質(zhì)時(shí)，該膜對待測物質(zhì)作出響應(yīng)，催化它的固有反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為電極中的電流或電位的變化，由計(jì)算機(jī)撲捉電信號，轉(zhuǎn)化為測定該物質(zhì)的數(shù)量數(shù)據(jù)。這樣生物傳感器就能夠快速、可靠地獲得酶解過程中某種或幾種特定的氨基酸含量來間接反映產(chǎn)物水解度和多肽分布的信息，實(shí)現(xiàn)酶解的在線動態(tài)監(jiān)測，為生物免疫活性肽制備的全自動控制提供了可能。所以，基于生物傳感器建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Artificial Neural Networks,ANNs)可用來實(shí)現(xiàn)生物活性肽制備的可視化。其具有自學(xué)習(xí)、自組織和自適應(yīng)功能，可以充分逼近任意復(fù)雜的非線性關(guān)系，大規(guī)模并行處理，使快速進(jìn)行大量運(yùn)算成為可能，有很強(qiáng)的魯棒性和容錯(cuò)性。正是由于BP-ANNs獨(dú)特優(yōu)勢，構(gòu)建鱈魚免疫活性肽制備的動態(tài)監(jiān)控模型具有可行性。因此，在線動態(tài)監(jiān)控模型的建立將為鱈魚蛋白免疫活性肽制備乃至其他特定功能生物活性肽的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。但根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和國內(nèi)外查新結(jié)果可知，生物傳感器在生物活性肽的酶法制備研究中尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監(jiān)控方法，從而解決目前沒有能夠及時(shí)準(zhǔn)確地在線監(jiān)控鱈魚免疫活性肽酶解制備的問題，為免疫活性肽制備乃至其他特定功能生物活性肽的開發(fā)提供技術(shù)支持，為鱈魚免疫活性肽實(shí)現(xiàn)在線控制制備提供了可操作依據(jù)。可應(yīng)用于生產(chǎn)鱈魚免疫活性肽及其他生物活性肽的在線監(jiān)控制備。本發(fā)明的一個(gè)方面確定鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16 17%時(shí)終止水解而制備的。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監(jiān)控方法，包括如下的步驟1)建立并訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，包括網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備、參數(shù)確定以及網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練步驟；A、網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備訓(xùn)練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進(jìn)行水解反應(yīng)，分別對每一酶解反應(yīng)的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進(jìn)行測定；B、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)確定包括有網(wǎng)絡(luò)模型的隱層數(shù)、傳遞函數(shù)、訓(xùn)練函數(shù)、學(xué)習(xí)函數(shù)、輸入層節(jié)點(diǎn)、輸出層節(jié)點(diǎn)、隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)；。C、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與建立以訓(xùn)練樣本為基礎(chǔ)，根據(jù)選定的輸入層節(jié)點(diǎn)的不同，建立并訓(xùn)練了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs網(wǎng)絡(luò)模型；2)確定酶解系統(tǒng)中初始的底物濃度、初始加酶濃度；3)利用生物傳感器監(jiān)測水解反應(yīng)中的特定的氨基酸每隔一定時(shí)間，將固定體積的酶解液注射到生物傳感器內(nèi)，利用特定氨基酸的氧化酶電極進(jìn)行檢測；4)將初始底物濃度、初始加酶濃度、特定氨基酸濃度等參數(shù)輸入到訓(xùn)練好的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得出水解產(chǎn)物的水解度，從而實(shí)現(xiàn)免疫活性肽的在線監(jiān)測。本發(fā)明確定了鱈魚蛋白的最佳水解度，從而為獲得最佳免疫效果的鱈魚免疫活性肽奠定了基礎(chǔ)。在確定了最佳水解度后，本發(fā)明建立了在線監(jiān)控方法，可以通過生物傳感器-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以在線監(jiān)測水解反應(yīng)程度。即使當(dāng)水解條件波動時(shí)，如溫度、pH、 攪拌速率等變化時(shí)，其仍可以準(zhǔn)確監(jiān)測水解反應(yīng)的程度。因此，本發(fā)明的方法具有很好的推廣應(yīng)用前景。


圖1 本發(fā)明的在線監(jiān)控方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)方面是確定鱈魚免疫活性肽的制備條件，將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，當(dāng)水解度在0 16%時(shí)，隨著水解度的增加，水解產(chǎn)物的免疫活性呈增加趨勢；當(dāng)水解度為16 17%時(shí)，水解產(chǎn)物呈現(xiàn)最高的免疫活性；當(dāng)水解度大于17%時(shí)，隨著水解度的增加，水解產(chǎn)物的免疫活性呈減小趨勢。因此鱈魚免疫活性肽可以控制水解度為16 17%進(jìn)行水解制備。鱈魚免疫活性肽制備條件的確定是通過體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對水解產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選，通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)免疫活性驗(yàn)證，確定制備鱈魚免疫活性肽所用的蛋白酶為胰蛋白酶，蛋白濃度25g/L、pH值8. 0、溫度(50士 1) °C、時(shí)間290min和加酶量24U/mg, DH為16. 87%，其水解產(chǎn)物體外脾淋巴細(xì)胞平均增殖率為28. 45%。該條件下的水解產(chǎn)物能顯著提高正常小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性(P < 0. 05)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(ρ < 0. 05)和單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P <0.05)。對于免疫功能低下小鼠，該水解產(chǎn)物能顯著提高小鼠的免疫器官指數(shù)(P < 0. 05)；顯著促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(ρ < 0. 05)，提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力(P < 0. 05)，提高小鼠的細(xì)胞免疫功能；提高血清溶血素含量(P < 0. 05)，促進(jìn)小鼠的體液免疫功能；顯著促進(jìn)小鼠的碳廓清能力(P < 0. 01)和腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)(P < 0. 05，P < 0. 01)，促進(jìn)小鼠的非特異性免疫功能。因此該條件下得到的水解產(chǎn)物對增強(qiáng)體內(nèi)免疫活性效果顯著。如圖1所示，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種鱈魚免疫活性肽制備的在線監(jiān)控方法，包括如下的步驟第一步建立并訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。包括網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備、參數(shù)確定以及網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練步驟。1)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備。訓(xùn)練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進(jìn)行水解反應(yīng)，分別對每一酶解反應(yīng)的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進(jìn)行測定。酶解反應(yīng)的水解度根據(jù)水合茚三酮法測定；游離谷氨酸和游離賴氨酸通過生物傳感器測定。2)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)確定。主要包括網(wǎng)絡(luò)模型的隱層數(shù)、傳遞函數(shù)、訓(xùn)練函數(shù)、 學(xué)習(xí)函數(shù)、輸入層節(jié)點(diǎn)、輸出層節(jié)點(diǎn)、隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)。<1>隱層數(shù)的確定。一個(gè)三層的BP網(wǎng)絡(luò)可以完成任意的N維到M維的映射，即對任何實(shí)際問題都可先選用1個(gè)隱層。<2>傳遞函數(shù)確定。一個(gè)三層前饋網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)隱層激活函數(shù)取非線性函數(shù)，輸入輸出層傳遞函數(shù)取線性激活函數(shù)，就能夠以任意精度逼近任意連續(xù)函數(shù)。因此，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數(shù)，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數(shù)。<3>網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)采用trainlm。LM法是梯度下降法與高斯-牛頓法的結(jié)合和改進(jìn)，是一種收斂速度快、魯棒性好的算法，適用于前向神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練。既具有梯度下降法的全局收斂特性，又具有高斯-牛頓法的局部快速收斂性。適應(yīng)性學(xué)習(xí)函數(shù)采用LEARNGDM。<4>由于各因素?cái)?shù)據(jù)的單位不統(tǒng)一，為了加快訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)的收斂性，改善網(wǎng)絡(luò)收斂誤差，更利于數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)在輸入前可作歸一化預(yù)處理。歸一化處理可以采用如下公式=Xi =(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，χ為訓(xùn)練樣本的輸入數(shù)據(jù)，Xi為歸一化后的數(shù)據(jù)，Xfflax與Xmin分別為訓(xùn)練樣本X中的最大值與最小值。<5>輸入層與輸出層節(jié)點(diǎn)的確定。輸入層節(jié)點(diǎn)為初始酶濃度、初始底物濃度&、水解產(chǎn)物的游離谷氨酸濃度[GLU]、終產(chǎn)物的游離賴氨酸濃度[LYS]；輸出層節(jié)點(diǎn)為DH。<6>隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)的確定。最基本原則在滿足精度要求的前提下取盡可能緊湊的結(jié)構(gòu)，即取盡可能少的隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)。隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)N2可取為禮=機(jī)+N3 +d(a =1 10)， 其中輸入節(jié)點(diǎn)為N1，輸出節(jié)點(diǎn)為N3, α為經(jīng)驗(yàn)值。合理隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)應(yīng)綜合考慮網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度和誤差大小的情況下確定。3)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與建立。以訓(xùn)練樣本為基礎(chǔ)，根據(jù)選定的輸入層節(jié)點(diǎn)的不同，分別建立并訓(xùn)練了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs網(wǎng)絡(luò)模型；最后對訓(xùn)練樣本進(jìn)行仿真，其擬合誤差的絕對值在0 5%。<l>GLU-BP-ANNs的動態(tài)監(jiān)控模型隱層為1層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數(shù)，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數(shù)，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)采用trainlm，適應(yīng)性學(xué)習(xí)函數(shù)采用LEARNGDM，輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、終產(chǎn)物的谷氨酸濃度[Glu]，輸出層節(jié)點(diǎn)為DH，隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為10。對樣本值與擬合值進(jìn)行回歸分析R2值為 0. 9967，擬合誤差范圍在0-4. 14%，擬合平均相對誤差值為1.06%。<2>LYS-BP-ANNs的動態(tài)監(jiān)控模型隱層為1層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數(shù)，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數(shù)，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)采用trainlm，適應(yīng)性學(xué)習(xí)函數(shù)采用LEARNGDM，輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、終產(chǎn)物的游離賴氨酸濃度[LYS]，輸出層節(jié)點(diǎn)為DH，隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為11。對訓(xùn)練樣本進(jìn)行仿真，其擬合誤差范圍在0 4. 56%，擬合平均相對誤差值為0. 94%。第二步確定酶解系統(tǒng)中初始的底物濃度、初始加酶濃度，在一定溫度、不斷攪拌的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。為了提高酶解效率，溫度選用酶的最適反應(yīng)溫度。第三步利用生物傳感器監(jiān)測水解反應(yīng)中的特定的氨基酸。每隔一定時(shí)間，將固定體積的酶解液注射到生物傳感器內(nèi)，利用特定氨基酸的氧化酶電極進(jìn)行檢測。生物傳感器進(jìn)樣的固定體積為25 μ L，測定時(shí)間為20秒，清洗時(shí)間為25秒。監(jiān)測的特定氨基酸分別為谷氨酸和賴氨酸。第四步將初始底物濃度、初始加酶濃度、特定氨基酸濃度等參數(shù)進(jìn)行歸一化處理后，輸入到訓(xùn)練好的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得出水解產(chǎn)物的水解度，從而實(shí)現(xiàn)免疫活性肽的在線監(jiān)測。為獲得免疫活性肽，將水解產(chǎn)物的目標(biāo)水解度控制在16 17%范圍，若符合要求，沸水浴中滅活酶5min終止水解反應(yīng)，然后迅速冷卻至室溫，調(diào)pH至中性，離心；若不在此范圍， 繼續(xù)進(jìn)行酶解反應(yīng)，直到符合要求，終止酶解反應(yīng)。實(shí)施例1 :GLU-BP-ANNs模型在線監(jiān)測制備免疫肽第一步建立并訓(xùn)練GLU-BP-ANNs網(wǎng)絡(luò)模型。1)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備。訓(xùn)練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進(jìn)行水解反應(yīng)，分別對每一酶解反應(yīng)的水解度和游離谷氨酸進(jìn)行測定。酶解反應(yīng)的水解度根據(jù)水合茚三酮法測定；游離谷氨酸通過生物傳感器測定。2)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)確定。隱層為1層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數(shù)， 隱層與輸出層之間使用線性purelin函數(shù)，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)采用trainlm，適應(yīng)性學(xué)習(xí)函數(shù)采用LEARNGDM，輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、產(chǎn)物的谷氨酸濃度[Glu]， 輸出層節(jié)點(diǎn)為DH，隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為10。3)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與建立。以訓(xùn)練樣本為基礎(chǔ)，建立并訓(xùn)練了 GLU-BP-ANNs網(wǎng)絡(luò)模型；最后對訓(xùn)練樣本進(jìn)行仿真，其擬合誤差的絕對值在0 5%。對樣本值與擬合值進(jìn)行回歸分析R2值為0. 9967，擬合誤差范圍在0-4. 14%，擬合平均相對誤差值為1. 06%。第二步底物為鱈魚排高壓勻漿，確定酶解系統(tǒng)中初始的底物蛋白濃度為25g/L、 初始胰蛋白酶濃度為600U/mL，在不斷攪拌的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。為了提高酶解效率，溫度選用酶的最適反應(yīng)溫度50°C。第三步利用生物傳感器監(jiān)測水解反應(yīng)中的谷氨酸。每隔IOminJf 25 μ L酶解液注射到生物傳感器內(nèi)，利用谷氨酸氧化酶電極進(jìn)行檢測。測定時(shí)間為20秒，清洗時(shí)間為25秒。第四步將初始底物濃度、初始加酶濃度、谷氨酸濃度等參數(shù)進(jìn)行歸一化處理后， 輸入到訓(xùn)練好的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，通過已建立的GLU-BP-ANNs監(jiān)控反應(yīng)體系的水解程度，利用生物傳感器監(jiān)測反應(yīng)體系中游離[Glu]變化，當(dāng)網(wǎng)絡(luò)顯示水解度在16-17%范圍內(nèi)時(shí)終止水解反應(yīng)，分別進(jìn)行5次獨(dú)立的水解實(shí)驗(yàn)，得到DH值試驗(yàn)值與仿真輸出值，經(jīng)歸一化處理后見表1。表IGLU-BP-ANNs監(jiān)測鱈魚排免疫肽制備
S0E0Glu試驗(yàn)值擬合值相對誤差 (%)0.57140.71430.42550.7080.7211.720.57140.71430.43970.7530.751-0.230.57140.71430.43500.7350.7410.820.57140.71430.44440.7440.7612.290.57140.71430.43970.7310.7512.81由表可以看出，試驗(yàn)的相對誤差僅在0. 23% 2. 81 %范圍，對于特別復(fù)雜的水解反應(yīng)來說，已經(jīng)在一定程度上實(shí)現(xiàn)了仿真監(jiān)控，對控制水解反應(yīng)有重要意義。活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此法制備的水解產(chǎn)物可以顯著的促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖活性，具有較好的免疫增強(qiáng)活性。實(shí)施例2 第一步建立并訓(xùn)練LYS-BP-ANNs網(wǎng)絡(luò)模型。1)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備。訓(xùn)練樣本是指利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進(jìn)行水解反應(yīng)，分別對每一酶解反應(yīng)的水解度和游離賴氨酸進(jìn)行測定。酶解反應(yīng)的水解度根據(jù)水合茚三酮法測定；游離賴氨酸通過生物傳感器測定。2)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)確定。一個(gè)隱含層，輸入層與隱層之間使用Iogsig傳遞函數(shù)，隱層與輸出層之間使用線性purelin函數(shù)，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)采用trainlm，適應(yīng)性學(xué)習(xí)函數(shù)采用LEARNGDM，輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度、初始底物濃度&、終產(chǎn)物的賴氨酸濃度 [LYS]，輸出層節(jié)點(diǎn)為DH，隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為11。3)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與建立。以訓(xùn)練樣本為基礎(chǔ)，建立并訓(xùn)練了 LYS-BP-ANNs 網(wǎng)絡(luò)模型；最后對訓(xùn)練樣本進(jìn)行仿真，其擬合誤差的絕對值在0 5%。對訓(xùn)練樣本進(jìn)行仿真，其擬合誤差范圍在0 4. 56%，擬合平均相對誤差值為0. 94%。第二步底物為鱈魚排高壓勻漿，確定酶解系統(tǒng)中初始的底物蛋白濃度為25g/L、初始胰蛋白酶濃度為600U/mL，在不斷攪拌的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。為了提高酶解效率，溫度選用酶的最適反應(yīng)溫度50°C。第三步利用生物傳感器監(jiān)測水解反應(yīng)中的賴氨酸。每隔IOminJf 25 μ L酶解液注射到生物傳感器內(nèi)，利用賴氨酸氧化酶電極進(jìn)行檢測。測定時(shí)間為20秒，清洗時(shí)間為25秒。第四步將初始底物濃度、初始加酶濃度、賴氨酸濃度等參數(shù)進(jìn)行歸一化處理后， 輸入到訓(xùn)練好的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，通過已建立的LYS-BP-ANNs監(jiān)控反應(yīng)體系的水解程度，利用生物傳感器監(jiān)測反應(yīng)體系中游離賴氨酸變化，當(dāng)網(wǎng)絡(luò)顯示水解度在16-17%范圍內(nèi)時(shí)終止水解反應(yīng)，分別進(jìn)行5次獨(dú)立的水解實(shí)驗(yàn)，得到DH值試驗(yàn)值與仿真輸出值，經(jīng)歸一化處理后見表2。表2LYS-BP-ANNs監(jiān)測鱈魚排免疫肽制備
權(quán)利要求
1.一種鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16 17%時(shí)終止水解而制備的。
2.制備權(quán)利要求1所述的鱈魚免疫活性肽的在線監(jiān)控方法，包括如下步驟1)建立并訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，包括網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備、參數(shù)確定以及網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練步驟；2)確定酶解系統(tǒng)中初始的底物濃度、初始加酶濃度；3)利用生物傳感器監(jiān)測水解反應(yīng)中的特定的氨基酸每隔一定時(shí)間，將固定體積的酶解液注射到生物傳感器內(nèi)，利用特定氨基酸的氧化酶電極進(jìn)行檢測；4)將初始底物濃度、初始加酶濃度、特定氨基酸濃度等參數(shù)輸入到訓(xùn)練好的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得出水解產(chǎn)物的水解度，從而實(shí)現(xiàn)免疫活性肽的在線監(jiān)測。
3.如權(quán)利要求1所述的在線監(jiān)控方法，其特征在于所述的步驟1)中的網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練樣本的制備，具體如下利用胰蛋白酶水解鱈魚蛋白，通過改變初始底物濃度與初始蛋白酶濃度進(jìn)行水解反應(yīng)，分別對每一酶解反應(yīng)的水解度和游離谷氨酸和游離賴氨酸進(jìn)行測定。
4.如權(quán)利要求1所述的在線監(jiān)控方法，其特征在于所述的步驟1)中的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)確定包括有網(wǎng)絡(luò)模型的隱層數(shù)、傳遞函數(shù)、訓(xùn)練函數(shù)、學(xué)習(xí)函數(shù)、輸入層節(jié)點(diǎn)、輸出層節(jié)點(diǎn)、隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)。
5.如權(quán)利要求1所述的在線監(jiān)控方法，其特征在于所述的步驟1)中的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與建立以訓(xùn)練樣本為基礎(chǔ)，根據(jù)選定的輸入層節(jié)點(diǎn)的不同，建立并訓(xùn)練了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs 網(wǎng)絡(luò)模型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鱈魚免疫活性肽，及其制備的在線監(jiān)控方法。所述的鱈魚免疫活性肽，其制備方法是將鱈魚蛋白用胰蛋白酶水解，水解度為16～17％時(shí)終止水解而制備的。并建立了GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs網(wǎng)絡(luò)模型，從而對鱈魚免疫活性肽的制備了在線監(jiān)控方法。本發(fā)明確定了鱈魚蛋白的最佳水解度，從而為獲得最佳免疫效果的鱈魚免疫活性肽奠定了基礎(chǔ)。在確定了最佳水解度后，本發(fā)明建立了在線監(jiān)控方法，可以通過生物傳感器-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以在線監(jiān)測水解反應(yīng)程度。即使當(dāng)水解條件波動時(shí)，如溫度、pH、攪拌速率等變化時(shí)，其仍可以準(zhǔn)確監(jiān)測水解反應(yīng)的程度。因此，本發(fā)明的方法具有很好的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號G06N3/02GK102559822SQ20121000361
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月7日
發(fā)明者侯虎, 張朝輝, 李八方, 趙雪 申請人:中國海洋大學(xué)