專利名稱：具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑及其制備方法和應用，屬生物農藥技術領域。
背景技術：
植物線蟲是一種世界范圍內普遍發生的植物病害，僅根結線蟲已知種類達70多種，危害3000多種植物，每年造成損失巨大。據聯合國糧農組織統計，每年全球因線蟲造成的損失高達1000億美元，2001年我國作物因受線蟲危害造成的損失高達233億元。松材線蟲被稱為無煙森林火災，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區嚴重發生，有向全國漫延的趨勢。更嚴重的是由于根結線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴重發生。
目前對線蟲防治仍以化學殺線蟲劑為主。發明于上個世紀40年代的化學殺線蟲劑，長期以來在保障農業生產，防治線蟲病中發揮了重要作用。但隨著科學技術的進步，發現許多化學殺線蟲劑均有副作用，不僅產生抗藥性，更造成環境污染，危害人體健康，相繼有不少被禁用或即將禁用。如美國已經禁止使用溴甲烷和二溴甲烷。化學殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障農業生產的同時，給人類健康和環境帶來了嚴重的負面影響，開發高效低毒殺線蟲劑和生物殺線蟲劑已經迫在眉睫。
單頂孢是一類非常重要的捕食線蟲真菌，它們能夠產生三維菌網等捕食器官捕促線蟲，是一類非常重要的線蟲生防資源。研究表明，秀麗單頂孢不僅能夠在CMA平板上產生捕器捕捉線蟲，同時分泌胞外蛋白酶，利用胞外蛋白酶分解線蟲體壁從而殺死線蟲。

發明內容
本發明的目的是通過對產生胞外酶并能夠有效分解線蟲體壁的秀麗單頂孢的研究，開發生物殺線蟲劑。
本發明篩選到的對植物寄生線蟲具有很好毒殺作用的秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)，YMF1.00027，YMF1.00027菌株已于2005年1月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏登記入冊的編號為CGMCC No.1310。
秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)，YMF1.00027營養菌絲無色，分隔，分枝；在CMA培養基上，28℃時生長速度快，菌落無色；分生孢子梗較長120～575μm，分隔，直立，有時產生較長分枝，頂端產生單個分生孢子；分生孢子紡錘形，大小為37.5～72.5×17.5～27.5μm，1～4個分隔，多為三個分隔，中央特大細胞明顯，該菌還能產生小分生孢子，倒卵形，大小為8～15×5～6μm，無隔。捕食器官為三維菌網。
本發明按常規方法制備，將秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027擴大培養后，提取殺線蟲有效成分，測定其對腐生線蟲(Pansgrellus redivivus)和松材線蟲的毒殺作用。
本發明是這樣實現的YMF1.00027菌株培養方法1.試管種培養培養基配方為改良型PDA培養基1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8％瓊脂；pH6.5。將YMF1.00027菌絲體接種到培養基上，22℃下培養8天，獲得試管種。
2.液體擴大培養(產酶培養)產酶培養基(PL-4)組成如下0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補充體積至1L，pH6.5。每個250ml三角瓶分裝60ml培養液，并加入少量的線蟲作為誘導物，121℃滅菌20分鐘，接入菌塊，26℃搖床(200rpm)培養6天。
殺線蟲活性成分的提取將發酵培養物過濾，收集上清液，按1∶0.56的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
殺線蟲活性試驗1、制備試驗用藥劑和對照用藥劑1)按前述液體擴大培養方法培養YMF1.00027菌株，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗用藥劑。
2)制備對照用藥劑對照1按制備試驗用藥方法制備，不同的是，培養液中不接入YMF1.00027菌株。
對照2將制備供試藥劑100℃煮沸30分鐘后作為對照，以證明殺線蟲有效成份是蛋白酶。
2、制備試驗用線蟲1)將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養基上，于28℃下培養6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養15至20天。用無菌水將線蟲洗下，稀釋成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗方法1)藥效試驗方法取試驗用藥劑200μl于1.5ml離心管中，分別加入Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲60條，離心管平放，置于25℃下，分別于12小時、24小時、36小時檢查計算線蟲的死亡率。并在光學顯微鏡下觀察，觀察線蟲體壁變化情況。
鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用三種對照藥劑，每處理重復三次。

分別用兩種對照藥劑進行對照試驗。
試驗設三個平行，兩次重復。
4、試驗結果表1 秀麗單頂孢 YMF1.00027對Panagrellus redivivus線蟲毒殺效果

表2秀麗單頂孢YMF1.00027對松材線蟲毒殺效果

結果表明，秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027菌株液體發酵產物中提取的試驗用藥劑對Panagrellus redivivus線蟲具較好的毒殺作用，36小時線蟲死亡率達100％，體壁完全溶解。從處理線蟲的變化來看，經歷了從部份體壁溶解到蟲體全部溶解的過程，說明活性成份主要為分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗用藥劑經過煮沸，導致蛋白質變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現溶解現象。說明秀麗單頂孢YMF1.00027菌株的活性成份主要為酶類。秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027菌株對松材線蟲有一定的毒殺作用，線蟲36小時的死亡率達85％，蟲體僵直。
本發明的秀麗單頂孢菌劑對線蟲Panagrellus redivivus和對松材線蟲具有較好的毒殺效果，可以作為線蟲生防菌劑進行開發。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
將YMF1.00027菌株接種到改良PDA斜面上，培養基配方為1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8％瓊脂；pH自然。將YMF1.00024菌絲體接種到培養基上，22℃下培養8天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養基中(每瓶裝60ml)，液體培養基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補充體積至1L，pH6.5。每個250ml三角瓶分裝60ml培養液，并加入少量的線蟲作為誘導物，121℃滅菌20分鐘，接入菌塊，26℃搖床(200rpm)培養6天。
按1∶0.56的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
本發明的使用效果見表1和表2。
權利要求
1.一種具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑，該菌劑由生產菌株和輔料經試管種培養、液體擴大培養及提取殺線蟲活性成份工序后得到，其特征在于生產菌株為秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027，YMF1.00027菌株已于2005年1月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏登記入冊的編號為CGMCC No.1310。
2.權利要求1所述菌劑的制備方法，包括試管種培養、液體擴大培養及提取殺線蟲活性成份，其特征在于
2.1液體發酵培養基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補充體積至1L，pH6.5；
2.2從液體發酵產物中提取殺線蟲有效成分的方法是將發酵培養物過濾，收集上清液，按1∶0.56的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清；用50mM磷酸緩沖液重新溶解，磷酸緩沖液為39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7.0；將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。
3.權利要求1所述的菌劑，其特征在于該菌劑對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可用于植物寄生線蟲生防。
全文摘要
本發明涉及一種具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。本菌劑的生產菌株為秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)，YMF1.00027，采用常規方法制備，其中液體發酵培養基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補充體積至1L，pH6.5。從液體發酵產物中提取殺線蟲有效成分的方法是，將發酵培養物進行過濾處理，上清液用硫酸銨進行濃縮處理即可做為殺線蟲的藥液。本發明的菌劑對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有效高的毒力，有較好的應用前景。
文檔編號A01N63/04GK1670178SQ20051001069
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者楊金奎, 張克勤, 周薇 申請人:云南大學