專利名稱：一種殺線蟲生物菌劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種殺線蟲生物菌劑及其制備方法和應用，屬生物農藥技術領域。
背景技術：
植物線蟲是一種世界范圍內普遍發生的植物病害，僅根結線蟲已知種類達70多種，危害3000多種植物，每年造成損失巨大。據聯合國糧農組織統計，每年全球因線蟲造成的損失高達1000多億美元，2001年我國作物受線蟲危害造成的損失高達233億元。松材線蟲被稱為無煙森林火災，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區嚴重發生，有向全國漫延的趨勢。更嚴重的是由于根結線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴重發生。
目前對線蟲防治仍以化學殺線蟲劑為主。長期以來，化學殺線蟲劑在保障農業生產，防治線蟲病中發揮了重要作用。但隨著科學技術的進步，發現許多化學殺線蟲劑均有副作用，不僅產生抗藥性，更造成環境污染，危害人體健康，相繼有不少被禁用或即將禁用。如美國已經禁止使用溴甲烷，二溴甲烷。化學殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障農業生產的同時，給人類健康和環境帶來了一定的負面影響，開發高效低毒殺線蟲劑和生物殺線蟲劑已經迫在眉睫。
輪枝菌是一類非常重要的生防真菌，其中很多都是重要的昆蟲和線蟲的病原真菌，能有效的防治多種有害昆蟲和線蟲，在植物的病原昆蟲和線蟲的生物防治中起著非常重要的作用。其中，蠟蚧輪枝菌和厚孢普可尼亞菌已經應用于生物殺蟲劑的開發，而有關刀孢輪枝菌對昆蟲和線蟲的作用目前尚未見報道。

發明內容
本發明的目的是通過對一株產生胞外酶并能夠有效分解線蟲體壁結構的內寄生真菌刀孢輪枝菌的研究，開發殺線蟲生物菌劑。
本發明人篩選到一株對植物寄生線蟲具有很好毒殺效果的內寄生真菌-刀孢輪枝菌Lecanicillium psalliotae，YMF1.00112。YMF1.00112菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2005年1月27日；保藏登記入冊的編號CGMCC No.1312。
刀孢輪枝菌Lecanicillium psalliotae，YMF1.00112系本發明人從線蟲體表分離的一株內寄生真菌，主要形態特征為在PDA培養基上生長較快，培養7天后菌落直徑達到3～6cm，菌絲生長致密，菌落顏色呈白色，背面淺黃至棕色；分生孢子梗輪狀著生，基部寬13～29μm，頂部寬0.2～0.5μm，分生孢子頭狀著生，橢圓形，鐮刀形，0.6～2.2×2.0～9.0μm，未見厚垣孢子。
本發明采用常規方法將刀孢輪枝菌擴大培養后，提取殺線蟲有效成分，測定其對腐生線蟲(Panagrellus redivivus)和松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的殺蟲效果。
本發明是這樣實現的YMF1.00112菌株培養方法1.試管種培養試管種采用常規方法培養，將YMF1.00112菌絲體接種到PDA培養基上，20-25℃下培養7～10天，獲得試管種。
2.液體擴大培養液體培養基配方為8-15g葡萄糖；0.8-1.5g硫酸銨；0.4-0.6g硫酸鎂；0.01-0.02g硫酸亞鐵；1000ml土豆浸出汁(100g土豆加1200ml水煮沸過濾，用水補足至1000ml)，pH6.5。用250ml三角瓶，每個裝60ml培養液，121℃滅菌20分鐘后接入試管種，26℃，200rpm下搖床培養6天。
提取殺線蟲活性成分將前述液體擴大培養好的菌液過濾后，用5KDa孔徑的超濾膜進行濃縮。濃縮液透析處理以后用陽離子交換柱進行純化，分別收集穿透峰和洗脫峰，生物活性測定表明大部分蛋白酶活性在洗脫峰，合并洗脫峰再用疏水柱進一步的純化，收集洗脫峰并用蒸餾水透析處理，電泳分析已達到電泳純。冷凍干燥把樣品凍干并溶解于2ml的蒸餾水中，-20℃保存，經過超濾膜濃縮以后的制劑即為殺線蟲制劑。
殺線蟲活性試驗1.制備試驗用藥劑和對照用藥劑1)制備試驗用藥劑按前述YMF1.00112菌株培養方法獲得菌液，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗用藥劑。
2)制備對照用藥劑對照1按制備試驗用藥方法制備，不同的是，培養液中不接入YMF1.00112菌株；對照2將制備供試藥劑100℃煮沸30分鐘后作為對照，以證明殺線蟲有效成份是蛋白酶。
2.制備試驗用線蟲1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養基上，于28℃下培養6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)
在100ml三角瓶中放入15g經水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3.試驗方法1)藥效試驗方法取試驗用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲60條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲分別于12小時、20小時；松材線蟲分別于12小時、20小時檢查并計算線蟲的死亡率。鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用2種對照藥劑進行對照實驗。
試驗設三個平行，兩次重復。
2)純化樣品的殺線蟲作用和對線蟲體壁的分解實驗方法同上，用光學顯微鏡觀察純化的樣品對線蟲體壁的分解作用。
4.試驗結果表1YMF1.001 12對Panagrellus redivivus線蟲殺蟲效果
表2YMF1.00112對松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)的殺蟲效果 結果表明，從YMF1.00112菌株液體發酵產物中提取的試驗用藥劑對Panagrellusredivivus線蟲和松材線蟲均具較好的殺線蟲效果。用5倍濃縮的樣品作為藥液處理線蟲，12小時后Panagrellus redivivus線蟲100％死亡并且線蟲完全被分解，松材線蟲死亡率也達到60％以上(表2)，20小時以后松材線蟲的死亡率也達到100％，但松材線蟲的體壁結構完整，沒有被分解。實驗結果同時表明，經陽離子柱純化的樣品的殺線蟲活性低于粗的濃縮樣品，說明有其它成分參與了殺線蟲的過程。
從處理線蟲的變化來看，經歷了從部份體壁分解到蟲體全部降解的過程，說明活性成份主為要分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗用藥劑經過煮沸處理，導致蛋白質變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現溶解現象，這也證明了YMF1.00112菌株對線蟲的活性成份主要為酶類。
本發明刀孢輪枝菌YMF1.00112是一種對線蟲具有較好毒殺作用功能的真菌，其主要作用成份是胞外酶，對線蟲特別是松材線蟲的毒力顯著高于或同等于以前報道的厚孢普可尼亞菌，具備了很好的應用開發前景。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
實施例一
將YMF1.00112菌株接種到PDA斜面上，20-25℃下培養8天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養基中，每瓶裝60ml，液體培養基配方為10g葡萄糖，1g硫酸銨，0.5g硫酸鎂，0.015g硫酸亞鐵，1000ml土豆浸出汁，pH6.5。每個250ml三角瓶分裝60ml培養液，121℃滅菌20分鐘后接入試管種，26℃，200rpm下搖床培養6天后，將菌液過濾，用5KDa孔徑的超濾膜進行濃縮。濃縮液透析處理以后用陽離子交換柱進行純化，分別收集穿透峰和洗脫峰，生物活性測定表明大部分蛋白酶活性在洗脫峰，合并洗脫峰再用疏水柱進一步的純化，收集洗脫峰并用蒸餾水透析處理，電泳分析已達到電泳純。冷凍干燥把樣品凍干并溶解于2ml的蒸餾水中，-20℃保存。經過超濾膜濃縮以后的制劑即為殺線蟲制劑。
實施例二基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方為8g葡萄糖；1.5g硫酸銨；0.6g硫酸鎂；0.01g硫酸亞鐵。
實施例三基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方為15g葡萄糖；0.8g硫酸銨；0.4g硫酸鎂；0.02g硫酸亞鐵。
本發明的使用效果詳見表1和表2。
權利要求
1.一種殺線蟲生物菌劑，該菌劑由生產菌株和輔料經試管種培養、液體擴大培養及提取殺線蟲活性成份工序后得到，其特征在于該生物菌劑的生產菌株為刀孢輪枝菌(Lecanicillium psalliotae)YMF1.00112，YMF1.00112菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期2005年1月27日；保藏號CGMCC No.1312。
2.權利要求1所述生物菌劑的制備方法，包括試管種培養、液體擴大培養及提取殺線蟲活性成分工序，其特征在于液體擴大培養基的配方為8-15g葡萄糖；0.8-1.5g硫酸銨；0.4-0.6g硫酸鎂；0.01-0.02g硫酸亞鐵；1000ml土豆浸出汁，pH6.5。
3.權利要求1所說的生物制劑，其特征在于該制劑對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可用于植物寄生線蟲生防。
全文摘要
本發明涉及一種殺線蟲生物菌劑及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。本發明的生物菌劑由生產菌株經試管種培養、液體擴大培養及提取殺線蟲活性成分的常規方法制備，其生產菌株為Lecanicillium psalliotae YMF1.00112，保藏號CGMCC No.1312。本發明制備方法中液體擴大培養基的配方為10g葡萄糖，1g硫酸銨，0.5g硫酸鎂，0.015g硫酸亞鐵，1000ml土豆浸出汁，pH6.5。本發明的殺線蟲生物菌劑對松材線蟲和Panagrellus redivivus線蟲具有毒殺作用，可用于植物寄生線蟲生防。本發明具有毒殺力高、有利于人體健康和環境保護等優點。
文檔編號A01N63/04GK1663394SQ20051001069
公開日2005年9月7日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者張克勤, 楊金奎, 周薇 申請人:云南大學