專利名稱：一種抗南方根結線蟲的番茄親本純系選育方法
技術領域：
本發明屬于番茄育種領域，涉及一種番茄的選育方法，特別涉及一種抗南方根結線蟲的番茄親本純系選育方法，該方法以分子標記輔助選擇和傳統選擇育種方法相結合，篩選出的親本純系可直接用于抗根結線蟲番茄雜交種的配組。
背景技術：
根結線蟲(Meloidogyne spp.)是危害栽培番茄(Lycoperisicon esculentum)十分嚴重的土傳性病害之一，其主要種類是南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)。隨著番茄保護地栽培面積的擴大和復種指數的提高，根結線蟲的危害日益嚴重，發病田的產量損失一般為30％～50％，嚴重時達70％以上。對于番茄的根結線蟲的化學防治和生物防治，由于污染生態環境或由于土壤抑菌作用，其生態效益和防治效果均不理想。因此，選育和利用抗性番茄品種就成為防治根結線蟲最有效的途徑，但目前國內尚無抗性番茄品種用于生產。抗性品種的育成有賴于抗性資源的發掘和利用，傳統的人工接種鑒定方法不僅程序復雜、結果不準確，而且很難區分抗性基因的純合體和雜合體，導致抗性基因的純合速度較慢，嚴重制約著番茄抗根結線蟲親本系和新品種的選育。

發明內容
針對上述抗根結線蟲番茄親本系和品種選育中存在的問題，本發明的目的在于，提出一種抗南方根結線蟲的番茄親本純系選育方法，該方法利用分子標記輔助選擇與傳統選擇育種相結合選育抗根結線蟲番茄親本系，操作簡便、結果可靠，所選育出的親本純系可直接用于抗根結線蟲番茄雜交種的配組。
為了實現上述目的，本發明采用如下的技術解決方案一種抗南方根結線蟲番茄親本純系的選育方法，其特征在于，該方法以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A的母本C為改良對象，以抗根結線蟲的番茄雜交種B為抗源，在苗期利用抗性基因的分子標記篩選抗根結線蟲材料，在大田利用傳統的育種方法選擇田間綜合性狀表現優良的材料，具體選育包括下列步驟1)對抗源進行苗期分子標記鑒定及成株期病圃抗性鑒定在分子標記鑒定的基礎上，將抗源移栽在根結線蟲病圃，對抗源進行成株期病圃抗性鑒定；選擇苗期分子標記鑒定和成株期病圃抗性鑒定確定攜帶Mi基因和抗病的作為轉育的抗源；2)以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A為母本，以抗根結線蟲的番茄雜交種B為父本進行人工授粉，收獲雜交種ABF1，進行單株DNA提取和PCR擴增，保留擴增出750bp條帶的植株，淘汰無擴增條帶的單株；對入選單株DNA的PCR擴增產物用核酸限制性內切酶Taq I消解，將SCAR標記轉化為CAPs標記；經酶切反應和電泳檢測后，淘汰不含Mi基因的單株，保留Mi基因純合株和Mi基因雜合株；3)將入選植株定植于田間根結線蟲病圃，進行病圃輔助鑒定及株型、第一花序著生節位、果色、果實形狀、抗性等重要農藝性狀的鑒定選擇，對具有突出優良性狀的植株按單株留種；4)以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A的母本C為輪回親本，以入選單株為非輪回親本，連續回交5～6代，每代繼續按上述方法進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，入選抗根結線蟲并且具有突出優良性狀的單株或株系，根據優良性狀的不同特點最終選擇3～5個株系，按株系留種；5)對入選株系連續自交2代，繼續進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，最終獲得含有純合抗性基因、具有不同突出優良農藝性狀的番茄親本系。
本發明帶來如下的技術效果(1)本發明首次將分子標記技術應剛于番茄育種材料的篩選，并與傳統育種方法相結合，有效地解決了番茄抗根結線蟲病圃鑒定程序繁瑣、鑒定結果不準確的問題。
(2)以2個生產上利用的番茄雜交種為基礎材料，有利于有利基因的積累，保證所獲得的親本株系具有高的配合力。
(3)以A品種的母本C回交多代，在其回交自交后代的入選株系中強化了C的優良性狀。


圖1為番茄抗根結線蟲SCAR標記的擴增效果圖。第1和第8泳道是Marker；第2～第3泳道無750bp條帶，視為不含Mi抗性基因；第4～第7泳道均出現了750bp條帶，需進一步進行CAPs標記分析。
圖2為番茄抗根結線蟲CAPs標記的酶切電泳圖。M泳道是Marker；第1～第4泳道酶切產物出現750bp、570bp和160bp三條帶，表示Mi基因雜合；第5泳道酶切產物出現570bp和160bp兩條帶，表示Mi基因純合。第6～第8泳道只有750bp一條帶，表示不含Mi基因。
圖3為親本系M02-28-3-6-12-69-158與對照(左)在南方根結線蟲抗性鑒定圃中的發病情況對比。
圖4為M02-69-9-62-32-49-216親本系與對照(左)在南方根結線蟲抗性鑒定圃中的發病情況對比。
圖5為M02-58-9-4-82-89-213親本系與對照(左)在南方根結線蟲抗性鑒定圃中的發病情況對比。
以下結合附圖和發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
本發明首次將分子標記技術應用于番茄育種材料的篩選，在苗期利用抗性基因的分子標記篩選抗根結線蟲材料，在大田利剛傳統的育種方法選擇田間綜合性狀表現優良的材料，最終選育出抗根結線蟲并具有突出優良性狀的番茄株系作為新一代雜交種的親本純系。其具體步驟如下(1)以我國目前生產上應用的綜合性狀優良但不抗根結線蟲的番茄雜交種A的母本C(番茄雜交種A及其母本C可從已育成番茄雜交種的單位或其制種單位索取)為主要改良對象，以從國外引進的抗根結線蟲的番茄雜交種B(可從市場上種子銷售門市或有種子進出口業務的公司，如中國種子集團公司、上海種業(集團)有限公司和上海沃爾農業科技有限公司等單位購買)為抗性來源。
(2)對抗源B進行苗期分子標記鑒定及成株期病圃抗性鑒定。具體方法是先播種抗源B，待其幼苗長至2～3片真葉時，采用微量法提取單株葉片的總DNA(鞏振輝等，以PCR鑒定轉基因植株的微量DNA提取方法.西北農業大學學報，1997，25(1)45～48)。根據已公開發表的番茄抗根結線蟲Mi基因的SCAR標記序列設計正反向引物(Williamson V M，Ho J Y，WuF F，et al.A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene.Mi，in tomato.Theoretical and Applied Genetics，1994，87757～763)，正向引物序列為5′-TCGGAGCCTTGG TCTGAATT-3′，反向引物序列為5′-GCCAGAGATG ATTCGTGAGA-3′。PCR反應總體積為15μL，其中包括模板DNA 2μL，正向引物(20μM)0.5μL，反向引物(20μM)0.5μL，dNTP(2mM)1.5μL，10×buffer(20mM，含Mg2+)1.5μL，ddH2O 8.5μL，Taq酶(2U/μL)0.5μL。PCR反應程序為95℃，5min；94℃，1min，59℃，1min，72℃，2min，30個循環；72℃，7min。利用該引物對抗源單株的總DNA進行PCR擴增，植株能擴增出一條約750bp的條帶；再用核酸限制性內切酶TaqI消解PCR擴增產物，將SCAR標記轉化為CAPs標記。酶切體系總體積為10μL，其中包括擴增產物7μL，5U/μL Taq I限制性內切酶0.5μL，10×buffer1.0μL，ddH2O 1.5μL。反應混合液在PCR儀65℃溫育1h。電泳檢測后，沒有被酶消解的只有750bp一條帶，這些單株小含Mi基因；能被酶消解的可出現兩條或三條酶帶，其中出現570bp和160bp兩條特異片段的為Mi基因純合株，而出現750bp、570bp和160bp三條特異片段的為Mi基因雜合株。Mi基因純合株或雜合株均可作為抗源。
在分子標記鑒定的基礎上，將抗源移栽在根結線蟲病圃對抗源進行成株期病圃抗性鑒定。
只有苗期分子標記鑒定和成株期病圃抗性鑒定確定攜帶Mi基因和抗病的可作為轉育的抗源。
(3)以A為母本、B為父本進行人工授粉，收獲雜交種ABF1。按上述方法進行單株DNA提取和PCR擴增。絕大部分植株擴增出了一條約750bp的條帶；少部分植株無擴增產物，視為不含根結線蟲Mi抗性基因(附圖1)，淘汰無擴增條帶的單株。
入選單株DNA的PCR擴增產物用核酸限制性內切酶Taq I消解，將SCAR標記轉化為CAPs標記。酶切反應按本說明書“具體實施方式
”中第(2)所述酶切方法進行。電泳檢測后，沒有被酶消解的只有750bp一條帶，這些單株不含Mi基因，予以淘汰；能被酶消解的可出現兩條或三條酶帶，其中出現570bp和160bp兩條特異片段的為Mi基因純合株，而出現750bp、570bp和160bp三條特異片段的為Mi基因雜合株(附圖2)。入選抗性基因純合與雜合的單株。
將入選植株定植于田間根結線蟲病圃，進行病圃輔助鑒定及株型、第一花序著生節位、果色、果實形狀、抗性等重要農藝性狀的鑒定選擇，對具有突出優良性狀的植株按單株留種。
(4)以A品種的母本C為輪回親本，以入選單株為非輪回親本，連續回交5～6代，每代繼續按上述方法進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，入選抗根結線蟲并且具有突出優良性狀的單株或株系。根據優良性狀的不同特點最終可選擇3～5個株系，按株系留種。
(5)對入選株系連續自交2代，繼續進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，最終獲得含有純合抗性基因、具有不同突出優良農藝性狀的番茄親本系。
以下是發明人給出的具體實施例，但本發明并不限于該實施例。
實施例(1)以我國綜合性狀優良但不抗南方根結線蟲的番茄雜交種“金棚一號”為母本(A品種，由西安金鵬種苗有限公司提供)，以從國外引進的含抗番茄根結線蟲基因Mi的雜交種Kelly(B品種，由山東壽光先正達種業有限公司提供)為父本進行雜交。
(2)對抗源B進行苗期分子標記鑒定及成株期病圃抗性鑒定。具體方法是先播種抗源B，待其幼苗長至2～3片真葉時，采用微量法提取單株葉片的總DNA(鞏振輝等，以PCR鑒定轉基因植株的微量DNA提取方法.西北農業大學學報，1997，25(1)45～48)。根據已公開發表的番茄抗根結線蟲Mi基因的SCAR標記序列設計正反向引物(Williamson V M，Ho J Y，WuF F，et al.A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in tomato.Theoretical and Applied Genetics，1994，87757～763)，正向引物序列5′-TCGGAGCCTTGG TCTGAATT-3′，反向引物序列5′-GCCAGAGATG ATTCGTGAGA-3′。PCR反應總體積為15μL，其中包括模板DNA 2μL，正向引物(20μM)0.5μL，反向引物(20μM)0.5μL，dNTP(2mM)1.5μL，10×buffer(20mM，含Mg2+)1.5μL，ddH2O 8.5μL，Taq酶(2U/μL)0.5μL。PCR反應程序為95℃，5min；94℃，1min，59℃，1min，72℃，2min，30個循環；72℃，7min。利用該引物對抗源單株的總DNA進行PCR擴增，植株能擴增出一條約750bp的條帶；再用核酸限制性內切酶TaqI消解PCR擴增產物，將SCAR標記轉化為CAPs標記。酶切體系總體積為10μL，其中包括擴增產物7μL，5U/μL Taq I限制性內切酶0.5μL，10×buffer1.0μL，ddH2O 1.5μL。反應混合液在PCR儀65℃溫育1h。電泳檢測后，沒有被酶消解的只有750bp一條帶，這些單株不含Mi基因；能被酶消解的可出現兩條或三條酶帶，其中出現570bp和160bp兩條特異片段的為Mi基因純合株，而出現750bp、570bp和160bp三條特異片段的為Mi基因雜合株。Mi基因純合株或雜合株均可作為抗源。
在分子標記鑒定的基礎上，將抗源移栽在根結線蟲病圃對抗源進行成株期病圃抗性鑒定。
通過苗期分子標記鑒定和成株期病圃抗性鑒定確定Kelly攜帶Mi基因和抗病，可作為轉育的抗源。
(3)以“金棚一號”A品種為母本，“Kelly”B品種為父本進行人工授粉，收獲雜交種ABF1。按上述方法進行單株DNA提取和PCR擴增。絕大部分植株擴增出了一條約750bp的條帶；少部分植株無擴增產物，視為不含根結線蟲Mi抗性基因(附圖1)。淘汰無擴增條帶的單株。
入選單株DNA的PCR擴增產物用核酸限制性內切酶Taq I消解，將SCAR標記轉化為CAPs標記。酶切反應按上述方法進行。電泳檢測后，沒有被酶消解的只有750bp一條帶，這些單株不含Mi基因，予以淘汰；能被酶消解的可出現兩條或三條酶帶，其中出現570bp和160bp兩條特異片段的為Mi基因純合株，而出現750bp、570bp和160bp三條特異片段的為Mi基因雜合株。入選抗性基因純合與雜合的單株。
將入選植株定植于田間根結線蟲病圃，進行病圃輔助鑒定及株型、第一花序著生節位、果色、果實形狀、抗性等重要農藝性狀的鑒定選擇，對具有突出優良性狀的植株按單株留種。
(4)以“金棚一號”的母本T15-28-6(A品種的母本C，由西安金鵬種苗有限公司提供)為輪回親本，以入選單株為非輪回親本，連續回交5～6代，每代繼續按上述方法進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，入選抗根結線蟲并且具有突出優良性狀的單株或株系。根據優良性狀的不同特點最終入選了3個株系，按株系留種。
(5)對入選株系連續自交2代，繼續進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間農藝性狀選擇，最后育成了三個優良親本系，定名為M02-28-3-6-12-69-158、M02-69-9-62-32-49-216和M02-58-9-4-82-89-213。
將上述3個優良親本系定植于番茄根結線蟲抗性鑒定圃，結果顯示這三個親本系均高抗南方根結線蟲(附圖3、圖4、圖5)。育成的三個親本系的主要特性如下M02-28-3-6-12-69-158有限生長粉紅果類型。植株生長勢較強，株高60～65cm，葉片較稀。主莖第六葉著生第一花序，三至四層封頂。果實高圓形，幼果無綠肩，光澤度好，成熟果粉紅色，一般單果重200～250g。果實硬度好，貨架壽命長，耐貯運。高抗根結線蟲和番茄花葉病毒。
M02-69-9-62-32-49-216無限生長粉紅果類型。植株生長勢較強，葉片較稀。主莖第七葉著生第一花序，以后每隔三葉著生一花序。果實高圓形，幼果無綠肩，表面光滑發亮，成熟果粉紅色，一般單果重250g左右。果肉厚，心室大，硬度好，貨架壽命長，耐貯運。高抗根結線蟲和枯萎病。
M02-58-9-4-82-89-213無限生長大紅果類型。植株生長勢較強，葉片較稀，節間較長。主莖第七葉著生第一一花序，以后每隔三葉著生一花序。果實高圓形，幼果無綠肩，果面光滑發亮無皺，成熟果粉紅色，一般單果重250g左右。果肉厚，硬度大，貨架壽命10～15天。高抗根結線蟲、葉霉病和番茄花葉病毒。
權利要求
1.一種抗南方根結線蟲番茄親本純系的選育方法，其特征在于，該方法以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A的母本C為改良對象，以抗根結線蟲的番茄雜交種B為抗性來源，在苗期利用抗性基因的分子標記篩選抗根結線蟲材料，在大田利用傳統的育種方法選擇田間綜合性狀表現優良的材料，具體選育包括下列步驟1)對抗源進行苗期分子標記鑒定及成株期病圃抗性鑒定在分子標記鑒定的基礎上，將抗源移栽在根結線蟲病圃，對抗源進行成株期病圃抗性鑒定；選擇苗期分子標記鑒定和成株期病圃抗性鑒定確定攜帶Mi基因和抗病的作為轉育的抗源；2)以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A為母本，以抗根結線蟲的番茄雜交種B為父本進行人工授粉，收獲雜交種ABF1，進行單株DNA提取和PCR擴增，保留擴增出750bp條帶的植株，淘汰無擴增條帶的單株；對入選單株DNA的PCR擴增產物用核酸限制性內切酶Taq I消解，將SCAR標記轉化為CAPs標記；經酶切反應和電泳檢測后，淘汰不含Mi基因的單株，保留Mi基因純合株和Mi基因雜合株；3)將入選植株定植于田間根結線蟲病圃，進行病圃輔助鑒定及株型、第一花序著生節位、果色、果實形狀、抗性農藝性狀的鑒定選擇，對具有突出優良性狀的植株按單株留種；4)以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A的母本C為輪回親本，以入選單株為非輪回親本，連續回交5～6代，每代繼續按上述方法進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，入選抗根結線蟲并且具有突出優良性狀的單株或株系，根據優良性狀的不同特點最終選擇3～5個株系，按株系留種；5)對入選株系連續自交2代，繼續進行苗期根結線蟲抗性基因分子標記篩選和田間病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇，最終獲得含有純合抗性基因、具有不同突出優良農藝性狀的番茄親本系。
全文摘要
本發明公開了一種抗南方根結線蟲番茄親本純系的選育方法，以綜合性狀好但不抗根結線蟲的番茄雜交種A的母本C為改良對象，以抗根結線蟲的番茄雜交種B為抗源，在苗期利用抗性基因的分子標記篩選抗根結線蟲材料，在大田利用傳統的育種方法選擇田間綜合性狀表現優良的材料，選育包括對抗源B進行苗期分子標記鑒定及成株期病圃抗性鑒定。以A為母本、B為父本進行人工授粉，并以A的母本C作為輪回親本連續回交5～6代，然后自交2代。每一世代都在苗期利用番茄抗根結線蟲Mi基因的CAPs分子標記對抗根結線蟲性狀進行篩選，在田間進行病圃輔助鑒定及農藝性狀選擇。最后選育出了含有純合抗性基因、具有不同突出優良農藝性狀的番茄親本純系。
文檔編號A01H5/00GK1903014SQ20061010442
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月31日 優先權日2006年7月31日
發明者鞏振輝, 逯明輝, 黃煒, 李大偉, 馬維, 李曉東, 鄭麗粉, 王建人, 蔡義勇 申請人:西北農林科技大學, 西安金鵬種苗有限公司