專利名稱：一種北方根結線蟲lamp快速檢測方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及北方根結線蟲LAMP快速檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
根結線蟲(Meloidogyne spp.)屬植物根系專性內寄生線蟲，是世界性分布的威脅全球農業生產的重要植物病原線蟲之一。迄今己記載的根結線蟲有90余種，其中南方根結線蟲(M. incognita)、爪睡根結線蟲(M. javanica)和花生根結線蟲(M. arenaria)和北方根結線蟲(M.hapla)是四種常見最重要的根結線蟲。在我國，這四種根結線蟲在大多數省(區)均有發生，侵染農作物達百種以上，致使寄主常年減產15 25%，有時達70%以上(徐建華，魏大為，詹裕定和程瑚瑞.江蘇省大棚蔬菜寄生線蟲的種類和發生.南京農業大學學報，1994，17 (I) :47-51).，嚴重地制約了大棚蔬菜、果樹、花卉等作物的生產和出口創匯。據估計，我國農作物的生產每年因根結線蟲的為害而遭受的經濟損失達數億元以上。據調查研究，我國分布最廣泛、最常見的根結線蟲與世界各地類似，包括南方根結線蟲(M. incognita)、爪睡根結線蟲(M. javanica)、 花生根結線蟲(M. arenaria)和北方根結線蟲(M. hap I a)。北方根結線蟲是1949年 Chitwood 在太平洋地區的咖啡樹上發現的(Chitwood, B. G. 1949. Root-knot nematodes. Part-I. A revision of the genus Meloidogyne Goeldi，1887. Proceedings of the Helminthological Society of Washington 16 90-104.)。根結線蟲的傳統鑒定方法主要根據形態學，主要是根據會陰花紋進行鑒定，但由于不同地理種群之間存在較大的變異性導致有時結果不夠準確。再者形態特征細微復雜， 對專業知識要求高，鑒定過程耗時、費力，且需要大量線蟲樣本，在單頭線蟲水平上不能達到要求。后來發展的同工酶技術能快速準確的鑒定不同的根結線蟲，但是它需要有適宜雌蟲的存在，因而不適用于多數情況下幼蟲和卵的檢測。由于形態學和同工酶技術的局限性，上世紀90年代起開始了根結線蟲分子鑒定的研究。目前針對根結線蟲的PCR診斷法主要基于rDNA的ITS和IGS序列的rDNA-PCR法， 基于 mtDNA 的 mtDNA-PCR-RFLP 法，基于 RAPD 的 SCAR-PCR 法。真核生物的rDNA在基因組內是以串聯重復序列的形式出現,每一串聯重復序列包括 3 個編碼區(18SrRNA，5. 8SRNA，28SRNA)和兩個 ITS (Internal Transcribed Spacers) 區，兩個串聯重復序列之間各一段IGS(Intergenetic Spaces)區。ITS是隨后發展起來的全新分子標記，其優點在于拷貝數多，同時包含保守和變異序列，根據保守序列中的變異位點設計特殊引物進行特異性擴增。Zi jlstra等(Zijlstra,C. ,Lever,A. Ε. Μ. ,Uenk,B. J. and Sifhout, C. H. Differences between ITS regions of isolates of root-knot nematode Meloidogyne hapIa and M. chitwoodi. Phytopathology, 1995,85 1231-1237. Zijlstra, C. ,Uenk,B. J. and Sifhout,C. H. A reliable,precise method to differentiate species of root-knot nematode in mixtures on the basis of ITS-RFLPs. Fundamental andApplied Nematology. 1997，20 :59-63.)分析了 Μ· hap I a 和 M. chitwoodi ITS 區的差異進行了 ITS-PCR-RFLP分析，發現用Aui I. Dra I、HinfI可將二者分開，并且還能將二者與 M. incognita 和 M. javanica 分開。Pertersen 等(Petersen，D. J.，Vrain, T. C. Rapid identification of Meloidogyne chitwoodi，M. hapla，and M.fallax using PCR primers to amplify thei ribosomal intergenic spacer. Fundamental and Applied Nematology. 1996，19 (6) :601_605·)使用 PCR 引物擴增 M. chitwoodi、M. hapla 和 M. fallax 的ITS區，實現了對3種根結線蟲的快速鑒定。Pertersen等(Pertersen，D. J.，Zi jlstra， C.，Wishart，J.，Blok, V. and Vrain，T.C. Specific probes efficiently distinguish root-knot nematode species using signature sequences in the ribosomal intergenic spacer. Fundamental and Applied Nematology，1997，20 :619_626.)根據 IGS區的差異，設計了 5條PCR引物，應用multiplex-PCR同時實現了對M. chitwoodi、 M. fallax和M. hapla的鑒定，其靈敏度可達單條幼蟲。然而Powers等(Power,T. O. ,Todd, T. C.，Burnell，A. M.，Murray, P. C. B.，Fleming，C. C.，Szalanski，A. L，Adams，B. A.，and Harris， T， S.The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes. Journal of Nematology. 1997,29(4) :441_450.)發現 Μ· incognita、 M. javanica和M. arenaria ITS序列一致，Hugall 等(HugalI, A.，Stanton，J. , and Moritz, C. Reticulate evolution and the origins of ribosomal internal transcribed spacer diversity in apomictic Meloidogyne. Molecular and Biological Evolution. 1999，16: 157-164.)通過序列分析發現3種多倍體的主要根結線蟲(M. incognita、M. javanica和 M. arenaria) ITS區遺傳變異較大，因此基于ri)NA的鑒別方法無法有效區分主要根結線蟲種群。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，是由 Wiliamson 等(Williams， J. G.，Kubelik，A. R.，Livak，K. J.，Rafalski，J. A.，and Tingey, S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Reaseareh. 1990,18 (22) :6531_6535.)和 Welsh 等(Welsh, J.，McClelland， M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Reaseareh. 1990,18(24) :7213_7218.)幾乎同時發明的，RAH)依賴一系列不同的隨機排列的寡核苷酸作為引物，對所研究的基因組DNA進行擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，經EB染色檢測擴增產物的多態性。近年來，SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)技術的得到了廣泛應用。Wiliamson 等(Williamson，V. Μ.，Caswel 1-Chen，Ε· P.，Westerdahl，B. B.，Wu，F. F.， and Caryl, G. Assay to Identify and Distinguish Single Juveniles of Meloidogyne hapla and M. chitwoodi. Journal of Nematology,29(I) 9-15.)通過對 M. chitwoodi 和M. hapla基因組DNA的RAPD分析，篩選出具有M. hapla種鑒定特征的特異性片段，經克隆測序后，設計了一對特異性引物，準確鑒定了 M. hapla ；Zi jlstra等(Zi jlstra，C.， Donkers-Venne, D.T.H.Μ. and Fargette, Μ.Identification of Meloidogyne incognita， M.javanica and M. arenaria using sequence characterized amplified region(SCAR) based PCR assays. Nematology，2000，2 :847_853)根據 Μ· incognita、Μ· javanica 和 M. arenaria 3種根結線蟲的RAPD標記，設計了 3對SCAR引物，快速、準確的鑒定了這3種線蟲；Zijlstra等(Zijlstra,C. ,Donkers-Venne,D. T. H. M. and Fargette,M. Identification of Meloidogyne incognita,M. javanica and M. arenaria using sequence characterized amplified region (SCAR) based PCR assays. Nematology, 2000, 2 847~853)利用 SCAR-PCR 同樣鑒定了 M. chitwoodi> M. fallax 和 M. hapla。以PCR為基礎的分子鑒定方法一定程度上克服了傳統形態鑒定上的缺陷。但PCR 檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(紫外儀)等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以檢測，需要較長的時間，限制了 PCR檢測方法在生產中的推廣應用。環介導恒溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是日本學者 Notomi (Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa Τ, Watanabe K, Amino N, Hase Τ. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research,2000, 28 e63.)發明的一種新式恒溫核酸擴增技術。反應采用能特異識別靶序列上6個位點的 4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在等溫條件下(65°C 左右)可以高效(30min 60min)、高特異的擴增目標DNA。在LAMP反應過程中，從dNTPs 中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子結合，能產生焦磷酸鎂沉淀物，出現渾濁沉淀，因此用肉眼就判定擴增結果，也可通過向其擴增產物中添加熒光染料通過變化來判定結果，也可通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察可以看到梯形條帶，尤其適宜于基層的簡潔快速檢測。LAMP反應具有簡單、快速、高效、經濟等特征。因而具有極為廣泛的應用前景目前，LAMP在動物疫病和食品安全方面廣泛應用，國內最早報道是在2002年北京奶牛中心運用引進的LAMP法進行胚胎性別的檢測。2009年日本Kikuchi (Kikuchi T， Aikawa T, Oeda Y, Karim N, Kanzaki N. A Rapid and Precise Diagnostic Method for Detecting the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated Isothermal Amplification. Nematology. 2009,12 1365-1369.)開發出松材線蟲 LAMP 快速檢測體系，能在I小時內檢測到松材線蟲。2011年Niu等(Niu J H，Guo Q X，Jian H， Chen C L,Yang D,Liu Q,Guo Y D. Rapid detection of Meloidogyne spp. by LAMP assay in soil and roots. Crop Protection 2011,8,1063-1069.)根據 18s_rDNA_ITS 序列差異，開發出能檢測根結線蟲及特異性檢測南方根結線蟲的LAMP檢測技術，2011年Niu等 (Niu, J. H. , Guo, Q. X. , Jian, H. , Chen, C. L. , Yang, D. , Liu, Q. , Guo, Y. D. Rapid detection of Meloidogyne spp. by LAMP assay in soil and roots. Crop Protection,2011,30 1063-1069.)根據根結線蟲rDNA-IGS的序列差異，開發出象耳豆根結線蟲LAMP檢測技術。

發明內容
本發明的目的是采用環介導等溫擴增技術(LAMP)建立檢測北方根結線蟲的LAMP 快速檢測方法。一種北方根結線蟲LAMP快速檢測方法，以北方根結線蟲DNA為模板，LAMP反應體系試劑中包括引物混合物、探針、反應緩沖液和反應酶，所述引物混合物有如下引物①MHF3 5，-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3，，②MHB3 5 ’ -TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3 ’，③MHFIP : 5 ’ -TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3 ’，
④MHBIP :5 ’ -TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3，，⑤MHLB 5，-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG—3，，所述方法還包括觀察檢測結果步驟，其特征在于在LAMP反應完的體系加入顯色劑，觀察顯色情況。所述顯色劑為SYBR green I。所述方法還包括觀察檢測結果步驟，其特征在于取LAMP擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶。所述方法還包括觀察檢測結果步驟，其特征在于引物混合物中MHFIP或MHBIP的 5’端帶有生物素標記，在LAMP反應產物中加入FITC標記的探針，63°C保溫5min，冷卻到室溫，取8 μ L的雜交液加入100 μ I PBS緩沖液，將LFD試紙浸入到雜交后的溶液中，通過觀察 LFD 試紙上的條帶，所述探針序列為MH-FITC-Probe :5’ -CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’， MH-FITC-Probe 的 5’ 端用 FITC 標記。所述引物混合液外引物MHF3和MHB3各O. 2 μ mol/L,內引物MHFIP和 MHBIP 各 I. 6 μ mol/L,環引物 MHLB 為 O. 4 μ mol/L,所述反應緩沖液6mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl(pH 8. 8),10mmol/L KCl,5mmol/L MgS04,lOmmol/L(NH4)2S04,0. I % Tritonx-100 ;反應酶8U Bst DNA聚合酶大片段。所述探針的濃度為20pmol/L。所述LAMP反應條件將引物混合液、反應緩沖液、反應酶混合均勻后加入I μ I DNA模板后，61 65°C保溫30 60min，82°C保溫5min。所述北方根結線蟲DNA的提取試劑組分配方如下I) WLB 溶液500mmol/L KCl, 10mmol /T, Tris-HCl, 1 Smmol /T, MgCl2,1. Ommol /I, DTT, 4. 5% Tween20,等體積混勻，過濾滅菌；2)蛋白酶 K : 20mg/mL 蛋白酶 K。所述北方根結線蟲DNA的提取方法為挑取單頭根結線蟲放入裝有10 μ I ddH20 的O. 2mL離心管中，加入8 μ I的WLB溶液，2 μ I蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融化后放入液氮中，重復6 7次，然后在-80°C下冷凍30min ;將離心管轉移到 65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應。本發明利用環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)建立針對北方根結線蟲的檢測方法。本方法具有多條引物的擴增，并在兩端形成了帶有引物功能的環狀結構，這種多引物結合和可自產生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強等特點，由于LAMP反應操作步驟簡單及反應產物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉淀，熒光劑顯色后可以用肉眼觀察判定反應結果，也可以用LFD試紙直接檢測反應結果，適用于各種實驗條件下檢測工作的使用，也適合在實驗條件不足的室外檢測。本發明的方法具體實施方案I、線蟲裂解液的配制I)WLB(Worm Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/ LMgCl2,1. Ommol/L DTT, 4. 5% Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。2)蛋白酶 K : 20mg/ml 蛋白酶 K。
2、線蟲DNA的提取挑取單頭北方根結線蟲放入裝有10 μ I ddH20的O. 2ml離心管中，加入8 μ I的WLB 溶液，2 μ I蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融后放入液氮中，重復6 7次，然后在-80°C下冷凍30min。然后將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin 處理后作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應。3、北方根結線蟲rDNA-ITS擴增及序列分析采用ITS 區的通用引物 rDNA I (5，-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3 ’ )和 rDNA2 (5，-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’ )擴增兩個北方根結線蟲種群ITS區片段。PCR擴增反應體系為 50μ 1，PCR 反應體系為 IOXBuffer(含 Mg2+)5y 1，IOmM dNTP 4μ1，引物 rDNAl 和 rDNA2 (10 μ mol/L)各 I μ I, Taq 酶(5U/ μ I, Takara) O. 5 μ 1，模板 DNA 5 μ I,滅菌 ddH20 補足至50 μ I。PCR擴增條件為95°C預變性5min，55°C退火30sec，72°C延伸Imin ;94°C變性 45sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，35 個循環；72°C再次延伸 10min，4°C保存。PCR 擴增后，取5 μ I擴增產物加I μ I加樣緩沖液在I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相回收、克隆和測序，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。4、北方根結線蟲LAMP引物設計根據北方根結線蟲ITS測序結果為模板，設計以下5條引物和一條探針，序列如下①MHF3 5，-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3，②MHB3 5，-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3 ’③MHFIP :5’ -TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’④MHBIP :5’ -TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’⑤MHLB 5，-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3，⑥MH-FITC-probe 5，-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3，LFD試紙檢測時，使用5 !端生物素標記的MHFIP引物和5 !端用FITC標記 MH-FITC-Probe 探針。5、LAMP反應體系配制外引物MHF3和MHB3各O. 2 μ mol/L，內引物MHFIP和MHBIP 各 1.6“11101/1，環引物腿1^為0.4 4 11101/1，10臟01/1 dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)， I Ommol/L KCl,5mmol/L MgSO4, lOmmol/L (NH4) 2S04，0· I % Triton x_100，8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ I DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。6、LAMP反應體系擴增條件將以上反應成分加入反應管中混合后，置于60 65°C 恒溫水浴中等溫擴增30 60min,82°C保溫5min。7、LAMP結果檢測結果可以采用以下三種檢測方法I)將上述反應完的體系中加入2μ I的顯色劑。輕晃混勻，即可肉眼觀察；2)取2 μ I擴增產物在2 %瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；3)在反應產物中加入5 μ L FITC標記的MH-FITC-Probe探針，63°C保溫5min，冷卻到室溫，取8 μ L的雜交液加入100 μ I PBS緩沖液，將LFD試紙浸入到雜交后的溶液中， 通過觀察LFD試紙上的條帶即可得到結果。
本發明所提供的北方根結線蟲LAMP快速檢測方法具有以下優點一、靈敏度高，對北方根結線蟲的檢測極限可低至1/200 000頭，檢測靈敏度比常規PCR高100倍。二、特異性強，所用的特異引物根據北方根結線蟲的ITS不同區域設計出5條引物，并與特異性探針結合，特異性比常規PCR要強。三、檢測時間短，Ih左右可獲得檢測結果，比常規PCR檢測節省2 4h。 四、儀器設備要求低，不需要普通PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統，只需要一個水浴鍋就可以完成檢測。五、操作簡單、結果明顯，整個檢測過程不涉及復雜儀器和設備，稍具分子生物學學基礎的人員即可完成。結果清晰明顯，肉眼即可觀察結果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。六、對人和環境友好，檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環境非常安全。綜上所述，本發明具有比現有PCR技術檢測北方根結線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實際生產中現場應用檢測。該技術可應用于對北方根結線蟲田間土壤樣品及植物上北方根結線蟲病發生的早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。


圖I北方根結線蟲ITS序列的LAMP引物和探針設計示意圖，A為北方根結線蟲LAMP引物和探針的位點，B為北方根結線蟲LAMP引物設計示意圖，圖2北方根結線蟲LAMP方法檢測，A為加熒光染料檢測結果，I :陽性結果，具有綠色熒光，2 :陰性對照，為深褐色。B 為檢測結果為電泳圖，M D2000DNA標準分子量(Takara) I :陽性結果，為LAMP擴增梯形條帶，2:陰性對照，無擴增產物。C為LFD試紙檢測結果圖，I :陽性結果，有測試帶和控制帶，2 :陰性對照，只有控制帶。圖3北方根結線蟲不同地理種群的LAMP檢測結果A為加熒光染料檢測結果，I =MHYJ, 2 =MHYN, 3 :陰性對照。B為電泳檢測結果，M D2000DNA標準分子量(Takara)，I =MHYJ, 2 =MHYN, 3 陰性對照。C為LFD試紙檢測結果，I =MHYJ, 2 =MHYN, 3 陰性對照。圖4北方根結線蟲LAMP方法特異性檢測結果A為LAMP加熒光染料檢測結果圖，I 13分別為MHYJ、MIDX、MEXED、MJYN、MAYN、 RSAM、PLD、DdCL、GS-14、GS-11、BD、BX 和陰性對照。B為LAMP檢測結果電泳圖，M D2000DNA標準分子量(Takara)，I 13分別為 MHYJ, MIDX、MEXED, MJYN、MAYN、RSAM、PLD、DdCL, GS-14、GS-11、BD、BX 和陰性對照。圖5北方根結線蟲LAMP方法靈敏度檢測結果A為LAMP加熒光染料檢測結果圖，I 8分別為單頭線蟲，10'10_2、10_3、10_4、 10_5、10_6和陰性對照。
B為LAMP檢測結果電泳圖，M D2000DNA標準分子量(Takara)，I 8分別為單頭線蟲，10—1、10_2、10_3、10_4、I O-5、10_6 和陰性對照。C為普通PCR法檢測結果電泳圖，M D2000DNA標準分子量(Takara)，I 8分別為單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6 和陰性對照。
具體實施例方式實驗材料共收集2個北方根結線蟲種群(MHYJ和MHYN)(見表I)。本實驗室均有保存，可以對公眾發放。表I供試北方根結線蟲種群及其來源
權利要求
1.一種北方根結線蟲LAMP快速檢測方法，以北方根結線蟲DNA為模板，LAMP反應體系試劑中包括引物混合物、反應緩沖液和反應酶，所述引物混合物有如下引物①MHF3 :5’ -GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’，②MHB3 :5’ -TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’，③MHFIP :5’ -TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’，④MHBIP :5’ -TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’，⑤MHLB :5，-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3，。
2.根據權利要求I所述的檢測方法，所述引物混合液為外引物MHF3和MHB3各O.2ymol/L,內引物 MHFIP 和 MHBIP 各 I. 6 μ mol/L，環引物 MHLB 為 O. 4ymol/L，所述反應緩沖液6mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl 的 pH 為 8· 8，10mmol/L KCl，5mmoI/LMgSO4, lOmmol/L (NH4) 2S04,0. 1% Triton x-100 ;反應酶8U Bst DNA 聚合酶大片段。
3.根據權利要求I或2所述的檢測方法，還包括觀察檢測結果步驟，其特征在于在 LAMP反應完的體系加入顯色劑，觀察顯色情況。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，所述顯色劑為SYBRgreen I。
5.根據權利要求I或2所述的檢測方法，還包括觀察檢測結果步驟，其特征在于取 LAMP擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶。
6.根據權利要求I或2所述的檢測方法，還包括觀察檢測結果步驟，其特征在于引物混合物中MHFIP或MHBIP的5’端帶有生物素標記，在LAMP反應產物中加入20pmol/L的 FITC標記的探針，63°C保溫5min,冷卻到室溫，取8 μ L的雜交液加入100 μ I PBS緩沖液， 將LFD試紙浸入到雜交后的溶液中，通過觀察LFD試紙上的條帶，所述探針序列為MH-FITC-Probe :5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’，MH-FITC-Probe 的 5’端用 FITC 標記。
7.根據權利要求1-6任一所述的檢測方法，所述LAMP反應條件將引物混合液、反應緩沖液、反應酶混合均勻后加入I μ I DNA模板后，61 65°C保溫30 60min，82°C保溫 5min。
8.根據權利要求I所述的檢測方法，所述北方根結線蟲DNA的提取試劑組分配方如下1)WLB溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. Ommol/L DTT,4.5% Tween20,等體積混勻，過濾滅菌；2)蛋白酶K:20mg/mL蛋白酶K。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，所述北方根結線蟲DNA的提取方法為挑取單頭根結線蟲放入裝有10 μ IddH2O的O. 2mL離心管中，加入8μ I的WLB溶液，2 μ I蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融化后放入液氮中，重復6 7次，然后在_80°C 下冷凍30min ;將離心管轉移到65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理后上清液作為線蟲 DNA模板直接用于LAMP和PCR反應。
10.權利要求1-9所述任一檢測方法在診斷植物、土壤的北方根結線蟲感染情況或鑒別北方根結線蟲中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種北方根結線蟲LAMP快速檢測方法及應用，屬生物技術領域。本發明根據克隆測序的北方根結線蟲ITS序列，在其序列保守區域設計了5條LAMP引物MHF3、MHB3、MHFIP、MHBIP和MHLB，探針MH-FITC-Probe5’端用FITC標記，其中MHFIP引物的5’端用生物素標記。通過對北方根結線蟲DNA提取，采用上述特異性引物混合物、反應緩沖液和反應酶，等溫擴增、擴增產物顯色檢測，從而快速檢測出北方根結線蟲。本發明的檢測方法特異性強、靈敏度高、成本低廉、操作簡便，靈敏度高，在北方根結線蟲現場快速檢測和北方根結線蟲病的早期診斷方面具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102586461SQ20121007092
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者何旭峰, 彭德良, 彭煥 申請人:中國農業科學院植物保護研究所