專利名稱：一種小麥-黑麥t2bl.1rs新易位系種質的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，創 制抗病、豐產性狀優異的種質資源，屬于農業生物技術育種研究領域。
技術背景小麥育種的突破取決于優異種質基因資源的發掘和利用。但是隨著 現代農業耕作制度的改進，栽培小麥種內的遺傳變異急劇減少，優異種 質資源日益匱乏。眾多的研究表明，小麥近緣植物蘊藏著許多豐富的、 有價值的基因資源。通過遠緣雜交，向栽培小麥種內導入外源優良基因， 拓寬小麥的遺傳基礎，既可創造新物種，又可選育出具有某種優良特性 的新類型。因此，發掘和利用近緣植物中的優異基因，創制優異種質材 料，就成為解決小麥育種種質資源匱乏的最佳途徑。小麥近緣植物黑麥是改良小麥產量、品質和抗性的重要基因源。它 具有大穗、多小穗、籽粒蛋白質和賴氨酸含量高等特點，而且具有抗條 銹、桿銹、葉銹和白粉的基因以及染色體相互作用所產生的優良性狀等 (參考文獻Schlegel R, Melz G Korzun V (1998). Genes, markers and linkage data of rye (Secale cereale L.): 5th updated inventory. Euphytica 101: 32-67,; Mcintosh RA， Yamazaki Y, Devos KM, Dubcovsky J， Rogers WJ, Appels R (2003). Catalogue of gene symbols for wheat. In: Pogna NE，Romand M， Pogna EA， Galterio Q eds. Proceedings of the 10th International Wheat Genetics Symposium. Paestum, Italy, pp. 1-6.)。通過種間特定的染色體易位和替換，目前在育成的小麥品種中，小麥-黑麥 T1BL.1RS易位系占推廣品種的10 70%，在我國則達到50 70%，它 們主要是黑麥品種Pekus的T1BL.1RS易位系。但是，近十多年來，隨著新的條銹病和白粉病病原小種(或菌系) 的出現和優勢小種(或菌系)的發展，黑麥品種IRS上的抗條銹病基因 rW，抗白粉病基因戶mS已經失效，抗葉銹基因丄"6的抗性也表現不穩 定，致使生產上主栽的原有小麥-黑麥T1BL.1RS易位系的品種陸續喪失 了對當前病害流行菌系的抗性，急需發掘和利用黑麥新的抗病優異種質 資源，以培育多抗、高產的小麥優良新品種。 發明內容本發明的目的在于針對目前生產上主栽的T1BL.1RS易位系品種因 病原新小種(菌系)的出現而陸續喪失抗性的問題，為了克服抗病品種 的單一化，增加抗源的多樣性，提供一個抗病、高產小麥-黑麥T2BL.1RS 新易位系種質的選育方法。本發明要解決的技術問題是通過如下技術方案實現的這種小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征包括以下步驟a、 親本選擇選擇普通小麥品種小偃6號為母本，以近緣植物黑 麥品種德國白粒為父本進行遠緣雜交；b、 遠緣雜交在母本小偃6號抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔 離；母本開花后第二天上午9 11點，下午3 4點用父本授粉，連續重復3次；授粉后繼續套袋，在授粉16 18天后采集幼穗于4。C冰箱 中保存48 72小時；C、幼胚拯救培養剝離步驟b中獲得的幼穗，將雜種Fo的幼胚于MS培養基上培養成苗，并在生根壯苗培養基上生根壯苗，4°C越夏， 經營養缽育苗后于當年的十月初移栽大田，獲得根尖細胞染色體數目為 2n二28的F,幼胚再生植株；d、 秋水仙素半浸根法染色體加倍將步驟c中獲得的幼胚再生植 株的部分根系，浸入0.05%的秋水仙素溶液中，進行染色體加倍，獲得e、 鑒定、回交種植步驟d的Fi種子，獲得根尖細胞染色體數目 加倍2n二56的F,植株；對Fi植株進行條銹病和白粉病的抗病性鑒定， 保留抗病的植株，并以步驟a中的原母本小偃6號作父本回交，獲得回 交種子；f、 鑒定、自交種植步驟e獲得的回交種子，對回交后代植株進 行細胞學鑒定，抗病性鑒定和農藝性狀調査，定向選擇綜合性狀優良的 單株自交，如此連續自交選育6代；采用連續的總基因組原位雜交技術 和三個探針的多色熒光原位雜交技術，對自交最終獲得的根尖細胞染色 體數目為2n=42=21"W單株鑒定，黑麥的一對1RS染色體臂代換了小 麥的一對2BS染色體臂，確認為T2BL.1RS易位的小麥-黑麥新種質。所述小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征在于 步驟c所述的幼胚拯救培養的生根壯苗培養基是如下重量比例的MS 培養基50%、蔗糖2%、烯效唑0.025%、水余量。所述小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征在于 步驟d所述的秋水仙素半浸根法染色體加倍是在次年春季3月中旬，在 步驟c中移栽到大田的F!幼胚再生植株一側，挖一直徑10cm左右的小 坑，露出1/2 2/3的根系，抖凈泥土，其余根系仍留在土中，將10ml 小燒杯傾斜放入小坑內，把露出的根系分蘗節輕輕塞入小燒杯內，然后 用吸移管注入營養液浸沒分蘗節，再在杯口處塞上浸過藥液的棉花，在 坑口蓋一塊塑料膜，用土覆蓋以減少藥液蒸發，每天早、中、晚三次向 燒杯內添加營養液至浸沒分蘗節，處理四天后，去掉燒杯，將根系至分 蘗節輕輕重新埋入土中，植株成熟收獲時按單株考査結實情況，獲得 Fj種子。所述小麥-黑麥T2BL.lRS新易位系種質的選育方法，其特征在于 所述的營養液是如下重量比例的秋水仙素0.05%、 二甲基亞砜1.5%、 MS培養基5M、水余量。所述的小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征在 于步驟e所述的抗病性鑒定包括人工接種鑒定對條銹病的抗性鑒定 以小麥品種銘賢169作感病對照，操作步驟為在每年春季3月上旬，在 麥苗的第一、二片心葉上去掉臘質后，用毛筆將條銹菌的病孢子涂抹在 第一、二片心葉上，并噴水保濕，兩周后等感病對照銘賢169充分發病 時調查抗病性，用反應型表示0—免疫，0;—近免疫，1—高抗，2—中 抗，3—中感，4—高感。所述的小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征在 于步驟e所述的抗病性鑒定包括自然誘發鑒定對白粉病的抗性操作步驟為在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔節期到灌漿期 45天內澆水3 4次以保持高濕環境，即可充分誘發白粉病，3 4周后 當感病對照銘賢169充分發病時調査抗病性，采用0 9級分級法O--免疫，1 2級--高抗，3 4級—中抗，5 6級—中感，7 9級—高感。本發明選育鑒定的小麥(小偃6號)-黑麥(德國白粒)T2BL.1RS 新易位系種質，不同于生產上一般常見的小麥-黑麥TlBL.lRS易位系， 它高抗條銹病當前流行菌系和白粉病的重要毒株，豐產性狀優異，為培 育突破性的抗病、高產小麥新品種奠定了優異的種質基礎。


圖1為連續GISH (A)和FISH (B)鑒定小麥-黑麥T2BL.1RS易位系的圖譜圖2為連續GISH (A)和FISH (B)鑒定小麥-黑麥T2BL.1RS易位系的圖譜圖3顯示的為小麥-黑麥T2BL.1RS易位系抗條銹病的鑒定結果 圖4顯示的為小麥-黑麥T2BL.1RS易位系抗白粉病的鑒定結果 圖5顯示的為小麥-黑麥T2BL.1RS易位系的農藝性狀 圖6顯示的為小麥-黑麥T2BL.1RS易位系的穗子和籽粒 圖中圖1A、圖2A分別顯示的是以digoxigenin-ll-dUTP標記的黑麥基 因組DNA為探針，中國春DNA為封組的GISH圖譜，其中小麥染色體 顯示紅色，黑麥染色體表現綠色，表明黑麥的一對染色體臂導入了小麥， 取代了小麥的一對染色體臂，形成了小麥-黑麥易位系。圖1B、圖2B分別顯示的是在圖1A、圖2A同一個細胞上(GISH)， 繼續采用一組p/ZvG38 (綠色)/pScl19.2 (紅色)探針(圖1B)和另外 一組p^sl (綠色)/p&119.2 (紅色)探針(圖2B)的FISH鑒定結果。 圖1B、圖2B表明導入小麥的一對黑麥染色體臂是黑麥1R染色體的短 臂，即1RS染色體，與其對應的小麥染色體為2B染色體的長臂，即2BL 染色體。三個探針相結合鑒定全部染色體的FISH結果表明該小麥-黑麥 易位系為一個小麥-黑麥T2BL.1RS易位系。圖3顯示的是小麥-黑麥T2BL.lRS易位系抗條銹病的鑒定結果。其 中a為黑麥品種德國白粒，對條銹病表現0級(免疫)；b為T2BL.lRS 易位系，表現l級(高抗)；c為對照小麥品種石4185，表現4級(高 感)。圖4顯示的是小麥-黑麥T2BL.1RS易位系抗白粉病的鑒定結果。其 中a為對照品種石4185，對白粉病表現7級(高感)；b為黑麥品種德 國白粒，表現0級(免疫)；c為T2BL.lRS易位系，表現2級(高抗)。圖5顯示的是小麥-黑麥T2BL.1RS易位系的農藝性狀。其中圖5A 為成熟的單株；圖5B為大田未成熟時的表現。圖6顯示的是小麥-黑麥T2BL.1RS易位系的穗子(正面和側面)和 籽粒。
具體實施方式
1、小麥(小偃6號)-黑麥(德國白粒)T2BL.1RS新易位系種質 的選育方法a、親本選擇小麥品種小偃6號(7H"cww ae幼Vww L.， 2n=42，AABBDD)，是由李振聲院士等利用長穗偃麥草和普通小麥遠緣雜交選 育出的一個冬小麥品種，具有優質、早熟、抗逆性強，適應性廣的特點， 被譽為我國小麥遠緣雜交育種中表現最突出的品種，是我國小麥育種重 要的骨干親本之一，但由于品種-…菌群互動，目前己喪失了對條銹病 和白粉病的抗性。黑麥為小麥的一個近緣種，是改良小麥產量、品質和抗性的重要基 因源，具有抗條銹、桿銹、葉銹，白粉、葉斑病和抗嫁蟲的特性。黑麥 作為異交植物，不同品種之間甚至品種內部都具有較高的遺傳多樣性。 選擇對條銹病當前流行菌系和白粉病毒株免疫的黑麥品種德國白粒 (5feca/e cerea/e L,; cv, German White, 2n=14， RR)為親本，以期將黑 麥的抗病性導入遺傳背景優良的骨干親本小偃6號中，創制優異種質資 源。b、遠緣雜交以小偃6號為母本，以黑麥品種德國白粒為父本， 配制雜交組合。在母本小偃6號抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔離； 母本開花后第二天上午9 11點，下午3 4點用父本授粉，連續重復3 次(天)；授粉后繼續套袋，在授粉16 18天后采集幼穗于4。C冰箱中 保存48 72小時；C、幼胚拯救培養由于遠緣雜交獲得的Fo有胚無乳，必需進行幼胚拯救培養才能生長成苗。因此，需剝離步驟b中獲得的幼穗，將雜種Fo的幼胚于MS培養基上培養成苗，并在成分是如下重量比例的"MS 培養基50%、蔗糖2%、烯效唑0.025%、水余量。"生根壯苗培養基上 生根壯苗，4。C越夏，經營養缽育苗后于當年的十月初移栽大田，獲得Fi幼胚再生植株。d、 秋水仙素半浸根法染色體加倍通過根尖細胞染色體和花粉母 細胞染色體制片，在顯微鏡下進行觀察，F,幼胚再生植株根尖細胞的染色體數目為2n=28;花粉母細胞染色體的構型為2n=21'W+7'R。由于 F,幼胚再生植株不結實，因此必需通過染色體加倍獲得后代種子。具體 操作是在次年春季3月中旬，在步驟c中移栽到大田的幼胚再生植株 一側，挖一直徑10cm左右的小坑，露出l/2 2/3的根系，抖凈泥土， 其余根系仍留在土中，將lOml小燒杯傾斜放入小坑內，把露出的根系 分蘗節輕輕塞入小燒杯內，然后用吸移管注入是如下重量比例的"秋 水仙素0.05%、 二甲基亞砜1.5%、 MS培養基5。/。、水余量。"營養液浸 沒分蘗節，再在杯口處塞上浸過藥液的棉花，在坑口蓋一塊塑料膜，用 土覆蓋以減少藥液蒸發。每天早、中、晚三次向燒杯內添加藥液至浸沒 分蘗節，處理四天后，去掉燒杯，將根系至分蘗節輕輕重新埋入土中。 植株成熟收獲時按單株考查結實情況，獲得Fi種子；e、 鑒定、回交種植步驟d的FJ中子，獲得染色體加倍的F,植株。 經細胞學鑒定，其根尖細胞的染色體數目為211=56。人工接種鑒定對條 銹病；自然誘發鑒定對白粉病的抗性，保留抗病的植株，并以步驟a中 的親本小偃6號作父本回交，獲得回交種子。人工接種鑒定對條銹病的抗性以小麥品種銘賢169作感病對照， 操作步驟為在每年春季3月上旬，在麥苗的第一、二片心葉上去掉臘質 后，用毛筆將條銹菌的病孢子涂抹在第一、二片心葉上，并噴水保濕， 兩周后等感病對照銘賢169充分發病時調査抗病性，用反應型表示0-免疫，0;—近免疫，1—高抗，2—中抗，3—中感，4—高感。自然誘發鑒定對白粉病的抗性 一般在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔節期到灌漿期45天內澆水3 4次以保持高濕環境， 即可充分誘發白粉病。3 4周后當感病對照銘賢169充分發病時調查抗 病性，采用0 9級分級法0—免疫，1 2級—高抗，3 4級—中抗，5 6級--中感，7 9級—高感。農藝性狀的精準鑒定通過對每一代小麥-黑麥材料進行農藝性狀 的詳細調查，包括株高，穗數，小穗數，穗粒數，不育小穗數，粒色，籽粒飽滿度、千粒重等，并以小麥區試對照品種石4185和親本小偃6 號為對照，定向選擇豐產性狀優良的后代材料。f、鑒定、自交種植步驟e獲得的回交種子，對回交后代植株進 行細胞學鑒定；人工接種鑒定對條銹病當前流行菌系；自然誘發鑒定對 白粉病的抗性；精準鑒定綜合農藝性狀。定向選擇形態特征趨向普通小 麥，育性正常，綜合農藝性狀優良，高抗或免疫條銹病和白粉病的單株 進行自交，如此連續自交選育6代，最終獲得編號為WR04-32的小麥-黑麥材料。2、小麥(小偃6號)-黑麥(德國白粒)T2BL.1RS新易位系種質 的鑒定結果2-1、連續基因組原位雜交(GISH、 FISH)鑒定由中科院遺傳與 發育生物學研究所植物細胞與染色體工程國家重點實驗室，對步驟f中 獲得的細胞學穩定的小麥-黑麥材料WR04-32 (2n=42=21"W)，采用連 續的總基因組原位雜交技術(GISH)和三個探針的多色熒光原位雜交技術(FISH)相結合，準確識別鑒定全部黑麥染色體(片段)和小麥染色體 (片段)的歸屬，確定小麥-黑麥易位系的組成。其中以黑麥基因組為 探針，中國春為封組的GISH表明，小麥染色體(染色體片段)顯示紅 色，黑麥染色體(染色體片段)表現綠色，證明步驟f中獲得的材料 WR04-32為一個小麥-黑麥易位系，如圖1A，圖2A所示。進一步在GISH 的同一個細胞上，采用p/7vG38 (綠色)/p5bl19.2 (紅色)和pjsl (綠 色)/p5H19.2 (紅色)兩組探針結合的FISH表明，步驟f中獲得的材 料WR04-32為黑麥的一對1RS染色體臂代換了小麥的一對2BS染色體 臂，確認為小麥-黑麥T2BLlRS易位系，如圖1B，圖2B所示。2-2、抗病性綜合鑒定在中科院欒城國家生態系統觀測臺站病圃 連續4年的抗病性鑒定結果表明，小麥-黑麥材料WR04-32高抗至免疫 條銹病當前流行菌系(CY30、 CY31、 CY32和水源類型)的混合菌系。 由中國農科院植保所進行的苗期分小種抗病性鑒定結果表明，WR04-32 免疫至近免疫條中CY28 (0-0;級)，免疫CY29; CY30和CY31 (0級)， 高抗CY32 (l級)。條銹病成株期抗性鑒定結果表明，WR04-32免疫條 中CY31 (0級)，高抗CY32 (l級)，高抗條銹病當前流行的混合菌系 (條中29號、條中30號、條中31號、條中32號、Su-4、 Su-6、 Su-ll、 Su-12、 Su-14)。對白粉病自然誘發鑒定和混合菌系的接種鑒定表現高抗 (2級)。WR04-32的親本小偃6號均高感條銹病和白粉病；黑麥品種 德國白粒均免疫條銹病和白粉病。目前生產上主栽的T1BL.1RS易位系 的代表性品種石4185 (國家區域試驗對照品種)不論對條銹病(4級)和 白粉病(7級)也均表現高感，如圖3、圖4所示。2-3、農藝性狀的精準鑒定最終選育出的代號為WR04-32的小麥-黑麥T2BL.lRS 易位系， 表現半冬性，中早熟，株高75cm左右，葉片 上挺，株型緊湊，莖稈粗壯，抗倒伏性強。穗層整齊，分蘗力強，成穗 率高(15個)，平均小穗數24個，穗粒數68個。穗長方型，長芒，白 殼，白粒，硬質。穗大、粒多，籽粒橢圓型，飽滿度好，千粒重40-42g。作為一個種質材料，小麥/黑麥T2BL.lRS易位系突出特點是由于外 源黑麥染色體的導入，其高抗條銹病(圖3)、白粉病(圖4)，綜合抗 病性強，并且株型緊湊，穗層整齊，分蘗力強，產量性狀優異，如圖5 和圖6所示。為了促進小麥/黑麥種質資源的有效利用，目前利用小麥-黑麥T2BL.1RS易位系已經配置了 100多個雜交組合。本發明列舉的實施例旨在進一步地闡述小麥-黑麥T2BL.1RS新易 位系種質的選育鑒定方法，而不對本發明的范圍構成任何限制。
權利要求
1. 一種小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征包括以下步驟a、親本選擇選擇普通小麥品種小偃6號為母本，以近緣植物黑麥品種德國白粒為父本進行遠緣雜交；b、遠緣雜交在母本小偃6號抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔離；母本開花后第二天上午9～11點，下午3～4點用父本授粉，連續重復3次；授粉后繼續套袋，在授粉16～18天后采集幼穗于4℃冰箱中保存48～72小時；c、幼胚拯救培養剝離步驟b中獲得的幼穗，將雜種F0的幼胚于MS培養基上培養成苗，并在生根壯苗培養基上生根壯苗，4℃越夏，經營養缽育苗后于當年的十月初移栽大田，獲得根尖細胞染色體數目為2n＝28的F1幼胚再生植株；d、秋水仙素半浸根法染色體加倍將步驟c中獲得的幼胚再生植株的部分根系，浸入0.05％的秋水仙素溶液中，進行染色體加倍，獲得F1種子；e、鑒定、回交種植步驟d的F1種子，獲得根尖細胞染色體數目加倍2n＝56的F1植株；對F1植株進行條銹病和白粉病的抗病性鑒定，保留抗病的植株，并以步驟a中的原母本小偃6號作父本回交，獲得回交種子；f、鑒定、自交種植步驟e獲得的回交種子，對回交后代植株進行細胞學鑒定，抗病性鑒定和農藝性狀調查，定向選擇綜合性狀優良的單株自交，如此連續自交選育6代；采用連續的總基因組原位雜交技術和三個探針的多色熒光原位雜交技術，對自交最終獲得的根尖細胞染色體數目為2n＝42＝21″W單株鑒定，黑麥的一對1RS染色體臂代換了小麥的一對2BS染色體臂，確認為T2BL.1RS易位的小麥-黑麥新種質。
2、 根據權利要求1所述小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方 法，其特征在于步驟c所述的幼胚拯救培養的生根壯苗培養基是如下 重量比例的MS培養基50n/c)、蔗糖2%、烯效唑0.025%、水余量。
3、 根據權利要求1所述小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方 法，其特征在于步驟d所述的秋水仙素半浸根法染色體加倍是在次年 春季3月中旬，在步驟c中移栽到大田的F!幼胚再生植株一側，挖一直 徑10cm左右的小坑，露出1/2 2/3的根系，抖凈泥土，其余根系仍留在 土中，將10ml小燒杯傾斜放入小坑內，把露出的根系分蘗節輕輕塞入小 燒杯內，然后用吸移管注入營養液浸沒分蘗節，再在杯口處塞上浸過藥 液的棉花，在坑口蓋一塊塑料膜，用土覆蓋以減少藥液蒸發，每天早、 中、晚三次向燒杯內添加營養液至浸沒分蘗節，處理四天后，去掉燒杯， 將根系至分蘗節輕輕重新埋入土中，植株成熟收獲時按單株考査結實情 況，獲得Fi種子。
4、 根據權利要求3所述小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方 法，其特征在于所述的營養液是如下重量比例的秋水仙素0.05%、 二甲 基亞砜1.5%、 MS培養基5。/。、水余量。
5、 根據權利要求1所述的小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育 方法，其特征在于步驟e所述的抗病性鑒定包括人工接種鑒定對條銹 病的抗性鑒定以小麥品種銘賢169作感病對照，操作步驟為在每年春 季3月上旬，在麥苗的第一、二片心葉上去掉臘質后，用毛筆將條銹菌 的病孢子涂抹在第一、二片心葉上，并噴水保濕，兩周后等感病對照銘 賢169充分發病時調查抗病性，用反應型表示0-免疫，0;--近免疫， 1—高抗，2—中抗，3—中感，4—高感。
6、 根據權利要求1所述的小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育 方法，其特征在于步驟e所述的抗病性鑒定包括自然誘發鑒定對白粉 病的抗性操作步驟為在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在 拔節期到灌漿期45天內澆水3 4次以保持高濕環境，即可充分誘發白 粉病，3 4周后當感病對照銘賢169充分發病時調查抗病性，采用0 9 級分級法0—免疫，1 2級—高抗，3 4級—中抗，5 6級—中感，7 9級--高感。
全文摘要
本發明提出一種小麥-黑麥T2BL.1RS新易位系種質的選育方法，其特征包括選擇普通小麥品種小偃6號為母本，以近緣植物黑麥品種德國白粒為父本進行遠緣雜交；經過幼胚拯救培養，秋水仙素半浸根法染色體加倍獲得種子，再經抗病性鑒定、細胞學鑒定、并以原親本小偃6號作父本回交，獲得回交種子；再經抗病性鑒定、細胞學鑒定，定向選擇綜合性狀優良的單株自交，如此連續自交選育6代，最終獲得的單株經采用連續的總基因組原位雜交技術和三個探針的多色熒光原位雜交技術鑒定，確認為小麥-黑麥T2BL.1RS易位系。它高抗條銹病當前流行菌系和白粉病的重要毒株，豐產性狀優異，為培育突破性的抗病、高產小麥新品種奠定了優異的種質基礎。
文檔編號A01H1/04GK101263782SQ200810054899
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者安調過, 張曉天, 濱 李, 王春梅, 王瑞芳, 琪 鄭, 強 高 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所