專利名稱：應用基于小麥est序列的黑麥染色體特異分子標記對黑麥5r染色體進行鑒定的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和遺傳育種領域，具體涉及基于小麥表達序列標簽(expressed sequence tag, EST)序列設計的分子標記，以及這些分子標記在跟蹤檢測黑麥染色體方面的應用。
背景技術：
小麥的近緣種黑麥cereale L.)具有許多優(yōu)良的性狀，如根系發(fā)達、分蘗強、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐鹽堿和酸性土壤，尤其是抗多種病害，如小麥白粉病iBlumeriagraminis f. sp. triiici)、條鎊病graminis f. sp. triiici )、口十鎊病(/*·triticina Eriks.)、桿鎊病(/*· graminis Pers. f. sp. triiici )、月星黑糖病(TilletiaControversa Kuhn, TCK)和大麥黃矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麥是對小麥進行遺傳改良，拓寬小麥遺傳基礎，增加小麥栽培品種遺傳變異的重要基因源。

黑麥中優(yōu)異基因向小麥中轉(zhuǎn)移的途徑主要是創(chuàng)制一系列小麥/黑麥雙二倍體、附加系、代換系和易位系。通過遠緣雜交和染色體工程等手段將黑麥染色體導入到小麥背景中，之后，還需要對其進行準確的鑒定，才能有效地加以利用。與細胞學技術和生化標記法相比，分子標記法簡單、快速和準確的特點使其廣泛地用于檢測、跟蹤導入小麥背景中的黑麥染色體。然而，目前開發(fā)的黑麥染色體的特異標記，多集中在黑麥的IRS染色體上，如SSR 標記 Bmac0213 (參考文獻Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphismanalysis using IRS-specific molecular markers in rye cultivars {Secale cerealeL.) of various origin. Cereal Res Commun, 36: 11-19), SSAP 標記 S10, S20, S17 (參考文獻:Nagy ED and Lelley T. 2003. Genetic and physical mapping of sequencespecific amplified polymorphic (SSAP) markers on the IRS chromosome arm in awheat background. Theor Appl Genet, 107: 1271-1277)，EST-STS 標記 STSwe3 和 STSwel26(參考文獻Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, andAn DG. 2009. Developmentand application of EST-STS markers specific to chromosome IRS of Secale cereale.Cereal Research Communications 37: 13-21)等。Zhuang 等(2008)報道了 1R,4R,5R,7R 染色體特異的 EST-SSR 標記(參考文獻Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL,Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheatEST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added inwheat. Acta Agron Sin, 34: 926-933)。Lee 等(2009)還報道了 6 個 2RL 染色體特異的EST標記(參考文獻Lee TG, Hong MJ, Johnson JW, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009.Development and functional assessment of EST—derived 2RL_specific markers for2BS. 2RL translocations. Theor Appl Genet, 119: 663-673)。以普通小麥EST序列開發(fā)分子標記，這樣的分子標記在其近緣物種中表現(xiàn)出很高的可轉(zhuǎn)移性(參考文獻Zhang LY, Bernard M, Leroy P, Feuillet C，Sourdille P.2005. High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals.Theor Appl Genet, 111: 677-687)。Zhang 等(2007)(參考文獻Zhang LY, Bernard M,Ravel C, Balfourier F, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P. 2007. Wheat EST-SSRsfor tracing chromosome segments from a wide range of grass species. PlantBreeding, 126: 251-258)進一步報道了小麥的EST標記能夠被用來跟蹤其許多近緣種的染色體片段。因此，利用小麥的EST序列來開發(fā)黑麥染色體特異的分子標記十分可行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一套基于小麥染色體上的EST序列而設計開發(fā)出的黑麥染色體特異的分子標記，借助這些分子標記能夠用普通PCR技術快速、準確的鑒定小麥遺傳背景中的IR 7R全部黑麥染色體，為黑麥染色體上的有益基因轉(zhuǎn)移到栽培小麥背景中提供簡便有效的分子鑒定方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是
基于小麥EST序列的黑麥IR 7R染色體特異的分子標記，這些分子標記為根據(jù)小麥染色體上的EST序列而設計的正向引物和反向引物，這些分子標記為用于鑒定黑麥IR 7R染色體的特異標記，其堿基序列見表1，
表1.根據(jù)小麥染色體表達序列標簽序列而設計的17對標記引物序列
權利要求
1.應用基于小麥EST序列的黒麥染色體特異分子標記對黒麥5R染色體進行鑒定的方法，其特征步驟包括 A、分子標記的選定和制備合成標記引物“11-MAG1242”，其正向引物序列見SEQ IDNO :21，其反向引物序列見SEQ ID NO 22 ； B、標記引物的稀釋將上步合成的標記引物，先用IXTE緩沖液溶解成IOOmmolじ1的母液放入-20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成IOmmolじ1的工作液待用；其中 IXTE 緩沖液的配方為，IOmmol じ1 Tris-HCl 與 Immol じ1 EDTA, pH=8. 0 ； C、黒麥染色體的特異標記 C-1、模板DNA的提取取待測物——小麥與黒麥的遠緣雜交后代材料，對照物0——不包含待測黑麥染色體的樣品，對照物I——包含待測黑麥染色體的樣品，然后利用常規(guī)DNA提取方法分別提取三者的DNA ； C-2、PCR擴增以C-1所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴增儀中分別對待測物、對照物0及對照物I進行擴增； C-3、擴增產(chǎn)物的檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟C-2所得的擴增產(chǎn)物，用銀染法進行染色，并在凝膠成像儀上照相； C-4、結果比對將待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對照物O、對照物I的電泳圖譜進行比對，如果待測遠緣雜交后代材料和對照物I的電泳圖譜均有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中有待測黑麥染色體；如果待測遠緣雜交后代材料的電泳圖譜與對照物0的電泳圖譜一致，均不含有特異擴增片段，說明遠緣雜交后代材料中不含有待測黑麥染色體。
2.根據(jù)權カ要求I所述的對黒麥染色體進行鑒定的方法，其特征在于步驟C-2中對所述待測物、對照物0及對照物I的DNA模板進行擴增的具體操作為，在體積為0. 2ml的Eppendof 管中依次加入 30ng 的模板 DNA, I XPCR buffer,1. 5mmol L1 MgCl2, 200mmol L1dNTP，正、反向引物各0. 2mmolじ1，0. 5U Taq DNA聚合酶，最后用無菌超純水補充反應體系至10ml，然后將Eppendof管放在GeneAmp9700基因擴增儀上進行擴增反應。
3.根據(jù)權カ要求2所述的對黒麥染色體進行鑒定的方法，其特征在于所述擴增反應的具體程序為，先94°C預變性5min ;然后94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸IminJM環(huán)38次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存。
4.根據(jù)權カ要求I所述的對黒麥染色體進行鑒定的方法，其特征在于步驟C-3中所述擴增產(chǎn)物的檢測方法具體為，在步驟C-2所得的擴增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液2W，混勻之后取3W用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳電壓為150 180V，電泳I 2h。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于小麥EST序列的黑麥5R染色體特異的分子標記，此分子標記為根據(jù)小麥染色體上的表達序列標簽序列而設計的正向引物和反向引物，用于鑒定黑麥5R染色體的特異標記；應用這些分子標記對黑麥5R染色體進行鑒定的基本步驟包括A、標記引物的選定和制備；B、標記引物的稀釋；C、黑麥染色體的特異標記C-1、模板DNA的提取，C-2、PCR擴增，C-3、擴增產(chǎn)物的檢測，C-4、結果比對。本發(fā)明基于小麥染色體上的EST序列設計開發(fā)出了一套黑麥染色體的特異分子標記，借助此分子標記能夠用普通PCR技術快速、準確的鑒定小麥遺傳背景中的5R黑麥染色體，為黑麥染色體上的有益基因轉(zhuǎn)移到栽培小麥背景中提供了簡便有效的分子鑒定方法。
文檔編號C12Q1/68GK103045724SQ201210366548
公開日2013年4月17日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權日2011年4月14日
發(fā)明者許紅星, 尹冬冬, 安調(diào)過, 李立會 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所