專利名稱：：一種抗生素生物農藥及其制備方法
技術領域：
：:本發明涉及一種抗生素生物農藥及其制備方法，屬于微生物發酵工程
技術領域：
。病蟲害每年給農業生產造成巨大損失，為了實現穩產高產，人們一直主要采用化學農藥給予控制?；瘜W農藥具有防效高、速度快、殺蟲抗菌譜廣、成本低、使用簡單等優點，因而得到了迅速發展，并成為防治病蟲害奪取農業生產豐收的一個重要手段。據統計，我國近些年化學農藥防治面積占總防治面積的比率高達95%左右。由于化學農藥的長期、大量和反復使用，帶來了對土壤、水體和大氣的污染；農副產品中農藥殘留增加，也直接危害了人類健康；同時，害蟲和病菌的抗藥性不斷加深和擴大，全世界至少已有500多種害蟲對農藥產生了抗性，有的害蟲抗性高達幾萬倍；此外，化學農藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益生物，破壞了生態平衡，引起害蟲更加猖獗。這樣，不得不加大農藥的施用量和頻度，從而造成化學農藥應用的惡性循環。我國是屬于人地關系非常緊張的地區，其出路在于大力發展生物農藥。本發明的目的是要克服現有技術缺陷，提供一種新的生物農藥，代替現有化學農藥用于防治紅蜘蛛、蚜蟲、菜青蟲等作物害蟲。為實現上述目的采取的技術方案本發明的生物農藥，其活性有效成份為農抗HA97502,分子式為C25H3704N，化學結構式其制備采用阿布拉鏈霉菌HA97502(5Yr印tcM^cesaZwraw'e/wisHA97502)為產生菌，通過微生物發酵培養技術生產。
背景技術：
：:發明目的:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>本發明的具體內容1.產生菌鑒定(1)形態特征菌株HA97502革蘭氏染色陽性；在高氏合成1號瓊脂和燕麥瓊脂等培養基上生長7天后，基內菌絲發育良好，無橫隔，不斷裂，多分枝；氣生菌絲生長豐富，分化形成孢子絲；孢子絲直至柔曲，孢子橢圓形，表面光滑。(2)培養特征菌株HA97502的培養特征見說明書附表1:(3)細胞壁類型分析菌株HA97502的全細胞水解液含有L,L-DAP(L，L-二氨基庚二酸Diamin叩imelicacid)，無特征性糖；細胞壁屬于I型，糖型C。(4)生理生化特征菌株的生理生化特征見說明書附表2。(5)16SrDNA序列分析菌株HA97502的16SrDNA序列見序列表與GenBank中相關序列Blast比較的結果表明，該菌株屬于鏈霉菌屬；與目前發表的相關菌株相比，菌株HA97502與阿布拉鏈霉菌(5Yr印to/sycesa6"raw'e/7sis)的16SrDNA序列一致，同源性為100%。根據形態特征、細胞壁組分和16SrDNA序列分析，菌株HA97502屬于鏈霉菌屬；其形態特征、16SrDNA序列和生理生化特征均與阿布拉鏈霉菌高度相似。故將菌株HA97502鑒定為阿布拉鏈霉菌(5"tre/t。早ce51a6"raw.e/57.51)。2.有效成份鑒定(1)有效成份的提取分離發酵液經過濾、溶劑提取、硅膠柱層析分離及高效液相色譜純化即得純品。具體流程見說明書附圖1。(2)有效成份的結構論證農抗HA97502的紫外有三個吸收峰，Amax(inMeOH)為233、238和267咖，與殺粉蝶菌素A相似。農抗HA97502的氫核磁共振譜('HNMR)，基本骨架的雜環及直鏈部分與殺粉蝶菌素Ai—致，其區別主要在于支鏈甲基部分。農抗HA97502的力醒R譜有二個CH3質子吸收峰的化學位移完全相同，均在1.74ppm處，且均為單峰，說明這二個CH3與同一個烯碳相連，具體結構見下圖。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>3.制備工藝-(l)生產菌種本發明所用的微生物菌種為阿布拉鏈霉菌HA97502(5Yre/^o/z^cesa^raw'e/sisHA97502),保藏于CGMCC(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)，保藏號CGMCCN0.2297,保藏日期為2007年12月14日，保藏地址為北京市朝陽區大屯路。(2)培養基①種子斜面培養基■30.1%、K2HP040.05%、MgS040.05%、NaCI0.05%、可溶性淀粉2.0%、瓊脂2.0%、蛋白胨O.1%，pH7.2~7.4。②發酵培養基培養基中的營養源采用常用的碳源和氮源。其中碳源可為玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、飴糖等；氮源可為玉米漿、尿素、蛋白胨、黃豆餅粉、酵母粉等。在此基礎上再添加一些其它營養成份，如食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。(3)培養條件培養溫度為22-34°c，培養ph值為4-10，培養時間為30~124小時。(4)產品后處理培養液經離心或過濾得菌體，菌體用溶劑提取后濃縮，或進一步進行硅膠柱層析等分離后，即可配制成所需含量的農藥制劑產品。具體工藝流程見說明書附圖2。本發明的顯著優點1.廣譜田間藥效實驗表明，農抗HA97502對紅蜘蛛、蚜蟲、菜青蟲等多種作物害蟲具有良好防治效果(80%以上)。2.髙效室內毒力測定表明，農抗HA97502在低濃度下即對多種作物害蟲具有毒殺作用，測定結果為柑桔紅蜘蛛LC5。2.3385ppm，瓜頓LC5。1.6819ppm，桃岈LC5。2.4222ppm,菜青蟲LCso5.0556ppm。3.價廉發酵培養基主要成分均為普通農副產品，發酵周期也比較短，因而生產成本比較低。-圖1為本發明的純品分離流程圖；圖2為本發明的產品制備工藝流程圖。具體實施例方式本發明有以下實施例實施例一農抗HA975021%制劑的制備在5噸發酵罐中，按甘薯淀粉3%、玉米粉2%、黃豆餅粉1.5%、尿素0.5%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.5%、碳酸鈣0.5%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%的配比配成3.5噸培養基(pH7.2~7.4)。按常規方法滅菌后冷卻至28°C，接種農抗HA97502產生菌，經28'C通氣培養58小時即得效價約1500ug/ml的發酵液。該發酵液經板框壓濾，菌體用1.5倍發酵液體積的95%工業酒精浸提三次，浸提液經真空濃縮除去酒精，稀釋至效價10000-11500ug/ml后，分裝即為1%制劑產品。實施例二農抗HA97502防治茄紅蜘蛛(1)供試藥劑和濃度供試藥劑為1%農抗HA97502制劑500倍、650倍、800倍稀釋液，對照藥劑為20%雙甲脒乳油1000倍稀釋液，空白對照為清水。(2)試驗方法試驗作物為茄子，試驗面積為666.7m2，共4個處理，重復3次，隨機區組排列。采用山東產"衛士"背負式手動噴霧器，用量按每666.7ir^45Kg藥液量進行全株均勻噴霧。噴藥前隨機選擇3點，每點選擇5株作為定點調查株，每株定點調查頂部5張葉片活蟲數。噴藥后24、48、72小時調査殘存活蟲數，計算蟲口減退率和校正防效。蟲口減退率(％)=[(施藥前活蟲數一施藥后活蟲數)/施藥前活蟲數]x100校正防效(％)=[(處理區蟲口減退率-對照區蟲口減退率)/(100-對照區蟲口減退率)]x100(3)試驗結果由下表可以看出，1%農抗HA97502制劑500倍稀釋液對茄紅蜘蛛有很好的防效，噴藥后24小時即發生作用，72小時防效為93.4%，優于20%雙甲脒乳油1000倍稀釋液(90.2%)。1%農抗HA97502制劑650倍、800倍稀釋液對茄紅蜘蛛的72小時防效分別為85.1%、75.9%。農抗HA97502防治茄紅蜘蛛田間藥效處理組藥前活蟲數(頭)藥后24小時藥后48小時藥后72小時活蟲數(頭)減退率(％)防效(%)活蟲數(頭)減退率(％)防效(%)活蟲數(頭)減退率(o/o)防效(%)HA97502500x84814283.383.812085.887.06192.893.4磨502650x83525569.570.422573.175.413783.685.1HA97502800x94443753.755.138759.062.524973.675.9雙甲脒lOOOx8715481.181.710187.688.78889.2卯.2清水792817-3.2/866-9.4/869-9.7/實施例三農抗HA97502防治菜青蟲(1)供試藥劑和濃度供試藥劑為1%農抗HA97502制劑500倍、650倍、800倍稀釋液，對照藥劑為2.5%溴氰菊酯乳油2500倍稀釋液，空白對照為清水。(2)試^方法試驗作物為甘藍，試驗面積為666.7m2，共4個處理，重復3次，隨機區組排列。采用山東產"衛士"背負式手動噴霧器，用量按每666.7m245Kg藥液量進行全株均勻噴霧。調查采用對角線5點取樣法，每點2株，每小區調查10株。噴藥前調查蟲口基數，噴藥后1天、2天、5天調查殘存活蟲數，計算蟲口減退率和校正防效，計算方法同實施例二。(3)試驗結果農抗HA97502防治菜青蟲田間藥效<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從上表可以看出，1%農抗HA97502制劑500倍液對菜青蟲5天后防效為85.1%，與2.5%溴氰菊酯乳油2500倍稀釋液相近。附表l菌株HA97502的培養特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>附表2菌株HA97502的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>GGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTMG1020TCCCGCMCGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGA1080CTCACAGGAGACTGCCGGGGTCMCTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATG1120CCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCG1180CGAGGCGGAGCGMTCCCAAMAGCCGGCCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACC1240CCATGMGTTGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGG1300GCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTA1360ACCCGTAAGGGGAGGAGCCGTCGMGGTGCGG139權利要求1.一種抗生素生物農藥，其特征是有效成份為農抗HA97502，分子式為C25H37O4N，化學結構式為id="icf0001"file="S2008100608083C00011.gif"wi="168"he="29"top="55"left="23"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.權利要求1所述抗生素生物農藥的制備方法，采用微生物發酵技術生產，其特征是產生菌為阿布拉鏈霉菌^repto歷ycesatoraWe/sj'sHA97502,菌種保藏于CGMCC，保藏號為CGMCCNo.2297。全文摘要本發明涉及一種抗生素生物農藥，該生物農藥的制備方法及應用。其特征是該生物農藥的活性成分為農抗HA97502，分子式為C₂₅H₃₇O₄N，化學結構式為該生物農藥的制備采用微生物發酵技術，生產菌種為阿布拉鏈霉菌HA97502(StreptomycesaburaviensisHA97502)；它是一種農用殺蟲劑，對農業生產上的重要害蟲紅蜘蛛、蚜蟲、菜青蟲等有特效。文檔編號A01N43/34GK101300980SQ200810060808公開日2008年11月12日申請日期2008年3月21日優先權日2008年3月21日發明者吳吉安,施躍峰,桑金隆,梁建根,竺利紅申請人:浙江省農業科學院