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一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌的制作方法

文檔序號(hào):356965閱讀:333來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域,更具體的說(shuō)是涉及一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌。
背景技術(shù)
胡椒(Piper nigrum L.)是胡椒科胡椒屬多年生常綠攀緣藤本植物,是世界重要的熱帶特色香辛料作物,為人們最常用、最喜愛的調(diào)味品之一,在食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域用途廣泛。胡椒瘟病是一種氣候依賴性病害,常在雨季時(shí)發(fā)生,它是由疫霉菌感染而引起的一種傳染力很強(qiáng)的土傳性病害。自引種胡椒以來(lái),胡椒瘟病就一直是危害我國(guó)胡椒生產(chǎn)的首要病害,病情嚴(yán)重時(shí)胡椒園損失達(dá)90%以上,甚至全園毀滅,給我國(guó)胡椒種植業(yè)帶來(lái)不可估量的損失,為此我國(guó)對(duì)胡椒瘟病的防治技術(shù)進(jìn)行了較為深入的研究。目前,對(duì)胡椒瘟病的防治主要依賴化學(xué)防治技術(shù),如噴施甲霜靈霜 霉威WP。雖然化學(xué)防治能夠達(dá)到較好的防治效果,但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留,降低胡椒品質(zhì),而且還會(huì)隨著化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期頻繁使用引起胡椒瘟病病菌的抗藥性,致使胡椒瘟病近年來(lái)有逐年加重之勢(shì)。因此,有效、安全、生態(tài)地防治胡椒瘟病就成為胡椒種植業(yè)的首要目標(biāo)。生物防治是現(xiàn)階段提出的一種防治胡椒瘟病的技術(shù)手段,它以胡椒瘟病菌株為指示菌,從土壤中中篩選出能夠抑制胡椒瘟病菌株的微生物進(jìn)行生物防治,這種方法有效避免了利用化學(xué)防治技術(shù)所帶來(lái)的抗藥性以及環(huán)境污染問(wèn)題。然而,胡椒瘟病菌株的組成類群十分復(fù)雜,而現(xiàn)有篩選時(shí)以典型或單一的胡椒瘟病菌株為指示菌,故篩選出的微生物具有一定局限性,其防治效果遠(yuǎn)不如化學(xué)防治效果。此外,現(xiàn)有篩選出的微生物隨著傳代次數(shù)的增加,其對(duì)胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性逐漸降低,遺傳穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明的目的在于提供一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌,使得該菌株防治胡椒溫病的效果與化學(xué)防治胡椒瘟病的效果無(wú)明顯差別,且具有較高的遺傳穩(wěn)定性。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供一種從胡椒葉片中分離得到的內(nèi)生菌,命名為菌株 S,菌株S在PDA平板表面生長(zhǎng)的菌落為圓形,表面中間突起,有光澤,并且生長(zhǎng)物粘稠;革蘭氏染色為陰性;芽孢染色為陽(yáng)性,芽孢一般在菌體中間;莢膜染色為陽(yáng)性(有莢膜形成); 鞭毛染色為陽(yáng)性,鞭毛為兩端生,運(yùn)動(dòng)能力不強(qiáng);菌體形態(tài)為桿狀,單生。接觸酶、V.P.反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化均為陽(yáng)性。檸檬酸鹽利用、脲酶試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)均為陰性。菌體在PH5. 7的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,不能在含有7 % NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。此外, 經(jīng)16S DNA檢測(cè)分析,與菌株S同源性高的50個(gè)菌株均是類芽孢桿菌,同源性高達(dá)99 %,結(jié)合生理生化特征,鑒定其為內(nèi)生多粘類芽孢桿菌。本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌已于2011年5月12日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏編號(hào)為CGMCC No. 4843。本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌傳代培養(yǎng)的第1代、第10代、第20代、第30代、 第40代對(duì)胡椒瘟病病菌孢子的抑制試驗(yàn)顯示,所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌從第1代至第40 代抑制胡椒瘟病病菌孢子萌發(fā)的EC5tl無(wú)顯著差異,且均在5. 13%以下,表明本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌具有較好的抑制效果,且遺傳穩(wěn)定性較高,不會(huì)隨傳代次數(shù)的增加而降低對(duì)胡椒瘟病病菌孢子的抑制活性。本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌與甲霜靈霜·霉威WP對(duì)胡椒瘟病防效試驗(yàn)結(jié)果顯示,兩者的防效相當(dāng),無(wú)明顯差異。表明本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌防效較高,達(dá)到化學(xué)防治的效果,能夠應(yīng)用在防治胡椒瘟病以及制備防治胡椒瘟病制劑中。本發(fā)明還提供一種生防制劑,包括保藏編號(hào)為CGMCC No. 4843的內(nèi)生多粘類芽孢桿菌。本發(fā)明所述生防制劑可以在胡椒移栽前噴霧使用,也可以做成堆肥使用,或者稀釋后在移栽時(shí)灌根使用。本發(fā)明所述所述生防制劑的制備方法如下將保藏編號(hào)為CGMCC No. 4843的內(nèi)生多粘類芽孢桿菌于PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng),然后過(guò)濾并調(diào)節(jié)菌液孢子數(shù)為IO8-IOki個(gè)/mL,即得生防制劑成品。其中,所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為^5-3(TC,更優(yōu)選為^°C,所述培養(yǎng)的天數(shù)優(yōu)選為 4-6d,更優(yōu)選為5d。由以上技術(shù)方案可知,本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌傳代至40代仍然具有較高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性,具有較高的遺傳穩(wěn)定性,同時(shí)其防治胡椒瘟病的效果達(dá)到化學(xué)防治的效果,且不污染環(huán)境,生態(tài)、安全,能夠廣泛應(yīng)用在胡椒瘟病的防治以及制備防治胡椒瘟病制劑中。生物保藏說(shuō)明分類命名多粘類芽孢桿菌,Paenikicillus polymyxa.于2011年5月12日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4843。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容,適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述,相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合,來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1 本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌的分離方法從胡椒瘟病發(fā)病重區(qū)采回生長(zhǎng)健康的葉片,用無(wú)菌手術(shù)刀切成約2cmX2cm規(guī)格的組織塊,無(wú)菌水沖洗數(shù)次,在75%的酒精中浸泡lmin,滅菌水沖洗3次,將組織塊置于無(wú)菌研缽中,用剪刀剪碎后加無(wú)菌水研磨,靜置30min,稀釋成IO-1UO-2UOl個(gè)梯度,分別移取最后1次沖洗液和研磨液各0. 3mL,涂抹于PDA培養(yǎng)基平板上,最后1次沖洗液作為CK, 于下培養(yǎng),逐日觀察。選擇CK中無(wú)菌落,而研磨液中長(zhǎng)出菌落的菌株,并根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落,純化編號(hào)后,在平皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)檢測(cè)其對(duì)胡椒瘟病病菌的抑制作用,選擇形成抑菌帶的菌株,命名為菌株S。實(shí)施例2 本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌生理生化以及16S DNA序列的測(cè)定1、生理生化檢測(cè)檢測(cè)菌株S在PDA平板上的生長(zhǎng)情況、菌落形態(tài)與顏色、革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等,方法參照方仲達(dá)主編的《植病研究方法》182頁(yè)的方法進(jìn)行。檢測(cè)菌株S的的生理生化特性,包括石蕊牛奶、接觸酶、V. P.反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)、氧化酶、M. R、苯丙氨酸脫氨酶、檸檬酸鹽利用、脲酶試驗(yàn)、丙酸鹽的利用、是否可以在含NaCl和pH5. 7的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)等試驗(yàn),方法參照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》353-385頁(yè)的方法。檢測(cè)結(jié)果如下在PDA平板表面生長(zhǎng)的菌落為圓形,表面中間突起,有光澤,并且生長(zhǎng)物粘稠;革蘭氏染色為陰性;芽孢染色為陽(yáng)性,芽孢一般在菌體中間;莢膜染色為陽(yáng)性(有莢膜形成); 鞭毛染色為陽(yáng)性,鞭毛為兩端生,運(yùn)動(dòng)能力不強(qiáng);菌體形態(tài)為桿狀,單生。接觸酶、V.P.反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化均為陽(yáng)性。檸檬酸鹽利用、脲酶試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)均為陰性。菌體在PH5. 7的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,不能在含有7% NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。2、16S DNA序列的測(cè)定參照Ausubel的細(xì)菌基因組DNA制備方法,用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 25μ1,其中 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1,Primer27F 和 Primerl492R(25pmoL) # 1 μ 1, dNTP Mixture 0.5 μ 1, Taq DNA Polymerase (5U/ μ 1)0. 5 μ 1,ddH20 17. 5 μ 1,DNA 模板 2 μ 1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C 4min ;95°C lmin,55°C 40s, 72°C 2min,共 30 個(gè)循環(huán); 然后 72°C保持 7min。PCR 產(chǎn)物用 EZ-10 SpinColum DNA Gel Extraction Kit 回收試劑盒進(jìn)行回收,并委托寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的基因序列用BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析,并與GenBank中已知的16S rDNA進(jìn)行同源性比較。檢測(cè)結(jié)果如下將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物在GenBank中(登錄號(hào)JF747221)進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明,與S菌株同源性高的50個(gè)菌株均是類芽孢桿菌屬(Paenikicillus sp.),其同源性達(dá) 99%,其中表1所示為與菌株S的16S rDNA同源性最高的10個(gè)菌株,由此可推斷菌株S屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)。表1 16S rDNA同源性比較
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌,其特征在于,保藏編號(hào)為CGMCC No. 4843。
2.權(quán)利要求1所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌在防治胡椒瘟病中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌在制備防治胡椒瘟病制劑中的應(yīng)用。
4.一種生防制劑,其特征在于,包括保藏編號(hào)為CGMCC No. 4843的內(nèi)生多粘類芽孢桿菌。
5.權(quán)利要求4所述生防制劑在防治胡椒瘟病中的應(yīng)用。
6.一種生防制劑的制備方法,其特征在于,將保藏編號(hào)為CGMCC No. 4843的內(nèi)生多粘類芽孢桿菌于PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng),然后過(guò)濾并調(diào)節(jié)菌液孢子數(shù)為IO8-IOki個(gè)/mL,即得生防制劑成品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法,其特征在于,所述培養(yǎng)的溫度為26-30°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法,其特征在于,所述培養(yǎng)的溫度為^°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法,其特征在于,所述培養(yǎng)的天數(shù)為4-6d。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法,其特征在于,所述培養(yǎng)的天數(shù)為5d。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域,具體公開了一種內(nèi)生多粘類芽孢桿菌。本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC No.4843。本發(fā)明所述內(nèi)生多粘類芽孢桿菌傳代至40代仍然具有較高抑制胡椒瘟病菌株孢子的活性,具有較高的遺傳穩(wěn)定性,同時(shí)其防治胡椒瘟病的效果達(dá)到化學(xué)防治的效果,且不污染環(huán)境,生態(tài)、安全,能夠廣泛應(yīng)用在胡椒瘟病的防治以及制備防治胡椒瘟病制劑中。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102250815SQ20111020521
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者劉愛勤, 桑利偉, 茍亞峰, 譚樂(lè)和, 鄔華松 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所
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